BLOK MDP

2019-2020

Mikrobiologi
- Pembuatan media pertumbuhan bakteri
- Teknik Sampling
- Teknik Inokulasi
- Hitung Koloni
The 5 I’s of Culturing Microbes
Inoculation – introduction of a sample into a
container of media to produce a culture of
observable growth
Isolation – separating one species from another
Incubation – under conditions that allow growth
Inspection
Identification

2
3
Isolation
• If an individual bacterial cell is separated from
other cells and has space on a nutrient surface, it
will grow into a mound of cells-- a colony.
• A colony consists of one species.

4
Figure 3.2 Isolation technique

Insert figure 3.2

Isolation technique

5
• Isolation techniques include:
• Streak plate technique
• Pour plate technique
• Spread plate technique

6
7
 Media: Providing Nutrients in the
Laboratory
Media can be classified according to three
properties:
1. Physical state – liquid, semisolid, and solid
2. Chemical composition – synthetic (chemically
defined) and nonsynthetic (complex)
3. Functional type – general purpose, enriched,
selective, differential, anaerobic, transport,
assay, enumeration

8
Table 3.1 Three Categories of Media

9
 Physical States of Media
Liquid – broth; does not solidify

Semisolid – contains solidifying agent

Solid – firm surface for colony formation

• Contains solidifying agent
• Liquefiable and nonliquefiable

10
Most commonly used media:
• Nutrient broth – liquid medium containing beef extract
and peptone
• Nutrient agar – solid media containing beef extract,
peptone, and agar

11
Media Agar padat
No Media Kegunaan
1 Agar Nutrient Mempelajari koloni bakteri
2 Agar Darah Membiakkan bakteri yang memerlukan nutrisi
tinggi dan melihat adanya reaksi hemolisis
3 Agar coklat Thayer Medium selektif untuk membiakkan Neisseria sp
Martin
4 Agar Endo Medium selektif dan diferensial untuk membiakkan
bakteri enterik
5 Agar Eosin Methylen Medium selektif dan diferensial untuk membiakkan
Blue (EMB) bekteri enterik

6 Agar Salmonella Medium selektif dan difrensial untuk membiakkan

Shigella Salmonella dan Shigella
7 Agar Thiosulphate Medium selektif dan diferensial untuk membiakkan
Citrate Bile Sucrose Vibrio cholera dan Vibrio sp lainnya
(TCBS)
12
Media Agar padat
No Media Kegunaan
8 Serum Loeffler Membiakkan Corynebacterium diphteriae
9 Agar Darah Telurit Medium selektif untuk membiakkan
Corynebacterium sp
10 Triple Sugar Iron Melihat kemampuan bakteri dalam meragi gula-
Agar gula dan membentuk H2S
11 Lowenstein Jensen Membiakkan Mycobacterium sp
12 Agar Sabouraud Membiakkan koloni jamur

13
Media Agar semisolid

No Media Kegunaan
1 semisolid Melihat gerak bakteri dan dapat juga untuk melihat
reaksi indol

14
Media Cair
No Media Kegunaan
1 Kaldu Membiakkan bakteri dan membuat suspensi
bakteri
2 Kaldu darah Membiakkan bakteri dan melihat hemolisis bakteri
3 Air pepton Membiakkan bakteri dan membuat suspensi
bakteri
4 Perbenihan Tarozzi Membiakkan bakteri anaerob
5 Perbenihan Perbenihan transpor dan persemaian untuk bakteri
Thioglicolat aerob dan anaerob
6 Perbenihan empedu Membiakkan bakteri enterik terutama Salmonella
7 Gula Air pepton Mengetahui kemampuan bakteri dalam
memfermentasi gula.
Gula yang digunakan :
a. Glucosa (tutup tabung kapas warna kuning)
b. Lactosa (tutup tabung kapas warna ungu)
c. Manitol (tutup tabung kapas warna hijau)
d. Maltosa (tutup tabung kapas warna merah)
15
Most commonly used solidifying agent is agar
• A complex polysaccharide isolated from red algae
• Solid at room temperature, liquefies at boiling (100oC)

16
 Berdasarkan Komposisi atau susunan bahannya
a. Media alami
• Komposisi media tidak diketahui secara pasti baik jenisnya maupun
ukurannya.
• tersedia secara alami misalnya air, nasi, buah, biji, daging dan lain-lain
b. Media sintetis  media buatan
• Komposisi senyawa berikut takarannya diketahui secara pasti, tidak
tersedia secara alami tapi dibuat
• mempelajari sifat genetika mikroorganisme.
• Contoh : sabouroud agar, czapek’s dox agar, cairan hanks dan lain-lain.
c. Media semi sintetis
• Komposisinya sebagian diketahui secara pasti, sebagian lagi tidak
disebut
• misalnya potato dextrose agar, nutrient agar, dan lain-lain.
Berdasarkan Bentuknya
a. Media cair  Komposisi dapat sintetis dapat pula alami. Keadaan
cair karena tidak ditambahkan bahan pemadat.
b. Media padat  ditambahkan bahan pemadat (agar-agar, amilum
atau gelatin).
c. Media semi padat  termasuk media padat tapi karena keadaanya
lembek disebut semisolid.
Berdasarkan Kegunaannya
a. Media umum  media ini dapat ditumbuhi oleh berbagai jenis
mikroorganisme baik bakteri maupun jamur misalnya N (nutrient
agar) dan lain-lain.
b. Media selektif  menyeleksi mikroorganisme sesuai dengan yang
diinginkan , jadi hanya satu jenis mikroorganisme saja yang dapat
tumbuh. Misalnya media salmonella sigella agar
c. Media diferensial  dapat ditumbuhi berbagai jenis mikroorganisme
tapi salah satu diantaranya dapat memberikan salah satu ciri yang khas
sehingga dapat dibedakan dari yang lain dan dapat dipisahkan
d. Medium pengaya  menumbuhkan mikroorganisme untuk
keperluan tertentu. Dibiakkan dalam medium ini supaya sel-sel
mikroorganisme tertentu dapat berkembang dengan cepat sehingga
diperoleh populasi yang tinggi.
Pembuatan Media
Alat dan bahan g. Kain kasa
a. Timbangan h. Kaca pengaduk
b. Kompor pemanas i. Benang atau tali
c. Gelas ukur 500 ml j. Autoklaf
d. Labu erlenmeyer 500 ml dan k. Beaker glass 500 ml dan 1000
1000 ml ml
e. Kapas l. alkohol 70%
f. Tabung reaksi m. Aquades
Membuat medium umum untuk bakteri (Nutrient Agar/NA dan Nutrien
Broth/NB)
a. NB manual
• Daging sapi tanpa lemak........................................... 500 gram
• Peptone ...................................................................... 5 gram
• Aquades ..................................................................... 1000 ml
b. NB instan
• NB ............................................................................. 20 gram
• Aquades ................................................................... 1000 ml
c. NA manual
• Daging sapi tanpa lemak .......................................... 500 gram
• Peptone ...................................................................... 5 gram
• Agar-agar .................................................................. 15 gram
• Aquades .................................................................... 1000 ml
d. NA instan
• NA ............................................................................. 20 gram
• Aquades ................................................................... 1000 ml
A. Media NA dan NB Manual
1. Cuci bersih daging sapi, buang bagian lemak jika masih ada
2. Iris daging dengan ukuran 1x1 cm2 , dimasukkan dalam beaker glass atau wadah dan ditambah
akuades sebanyak 500 mL
3. Rebus atau masak daging selama 25 menit atau sampai daging lunak (jaga agar volume air
tetap, jika berkurang tambahkan akuades)
4. Saring rebusan daging sehingga diperoleh air kaldu, campurkan dengan pepton, agar dan
akuades hingga volume akhir 1000 mL (pada pembuatan NB, tidak perlu ditambahkan agar)
5. Panaskan kembali campuran kaldu, pepton dan agar, aduk hingga homogen dan tunggu sampai
mendidih, dinginkan pada suhu ruang
6. Cek pH medium menggunakan pH meter dan atur pada pH 7
7. Masukkan medium kedalam tabung reaksi masing-masing 10 ml untuk media tegak dan 5-7 ml
untuk media miring
8. Tutuplah tabung berisi medium dengan kapas yang telah dibungkus kain kasa
9. Sterilkan dengan autoklaf. Media tegak biarkan tabung dalam keadaan berdiri dan untuk media
miring tabung miringkan dengan catatan media tidak sampai menyentuh tutup tabung
Media NA dan NB Instan
1. Timbang media sesuai kebutuhan (penghitungan jumlah mengacu pada takaran
yang tertera pada kemasan)
2. Larutkan 20 gram bubuk atau serbuk NA/NB instan ke dalam 1000 ml akuades
3. Aduk hingga serbuk larut, panaskan diatas penangas ditunggu hingga mendidih
(larutan terlihat jernih)
4. Dinginkan dan dituang pada cawan petri maupun tabung reaksi serta
disterilisasi dengan autoklaf
Incubation, Inspection, and Identification
Incubation – temperature-controlled chamber
• Microbe multiplies and produces macroscopically
observable growth
Inspection – observation; macroscopic and microscopic
• Pure culture – grows only single known species of
microorganisms
• Mixed cultures – hold two or more identified species or
microorganisms
• Contaminated culture – once pure or mixed culture that
has unwanted microbes growing

25
Figure 3.12 Various conditions of cultures

26
Incubation, Inspection, and Identification
Identification – macroscopic and microscopic
appearance, biochemical tests, genetic
characteristics, immunological testing

27
 Disposal of Cultures
Potentially hazardous cultures and specimens are
usually disposed of in two ways:
• Steam sterilization
• Incineration

28
Teknik Pengambilan Sampel
1. Sampel padatan (tanah, bahan makanan
dan lain-lain)
Ambil sampel dalam jumlah yang secukupnya minimal 100 g

masukkan dalam wadah steril atau alumunium foil

berikan label lokasi dan tanggal pengambilan

homogenisasi dengan penggerusan atau pengadukan

butiran

larutkan dalam air fisiologis
Sampel air
• Mengambil air dengan botol yang dicelupkan dengan tali
• air sungai yang mengalir maka botol dicelupkan miring dengan bibir
botol melawan arus air
• sampel air dari air kran maka sebelumnya mulut kran dibakar dan air
kran dibiarkan mengalir dulu.
Sampel Udara
medium padat dalam cawan petri (NA dan PDA) dengan penutup
cawan petri dibiarkan terbuka selama 10 menit.
Sampel dari bahan atau jaringan

• Teknik swab
Caranya dengan mengusapkan cotton bud memutar sehingga seluruh
permukaan kapas kontak dengan permukaan sampel.
• Teknik rinse
melarutkan sel-sel mikroorganisme yang menempel pada permukaan
substrat yang luas tetapi relatif berukuran kecil.
mencelupkan sampel ke dalam aquades dengan perbandingan 1:9.
Contohnya sampel daun ditimbang 5 gram kemudian dibilas dengan
aquades 45 ml yang terdapat dalam beaker glass.
Maseration (penghancuran)
Sampel yang berbentuk padat

ditumbuk dengan mortar dan pastle sehingga mikroorganisme yang
ada di permukaan atau di dalam dapat terlepas kemudian dilarutkan ke
dalam air.

Contoh sampelnya adalah dari makanan antara lain bakso, biji, buah dll.
Perbandingan antara berat sampel dengan pengenceran pertama
adalah 1:9.
Metode Plating
• Inokulasi cawan
petri dari seri
pengenceran

Figure 6.16
 Teknik Isolasi
Cara Pengenceran Bertingkat
• Tujuan : memperkecil atau
mengurangi jumah
mikroorganisme yang
tersuspensi dalam cairan
• Setelah inkubasi,hitung
koloni pada cawan yang
memiliki jumlah 25-250
koloni (CFU)
Syarat-syarat Perhitungan
• Hitung jumlah koloni, kalikan jumlah koloni (atau rerata
jumlah jika digunakan ulangan dalam pengenceran yang
sama) dengan kebalikan pengencerannya.
Koloni per mL (cfu/mL) = Jumlah koloni x (1/FP)

FP (faktor pengenceran)

• Catat pengenceran yang digunakan dan jumlah koloni

dihitung atau diduga pada tiap petri.
• Laporkan jumlah (atau dugaan jumlah) sebagai cfu per g
atau ml.
Syarat-syarat Perhitungan
• Hitung jumlah koloni. Hanya yang memenuhi syarat yang
dihitung.
• Beberapa koloni yang bergabung menjadi satu
merupakan suatu kumpulan koloni yang besar dimana
jumlah koloni diragukan, dapat dihitung sebagai satu
koloni.
• Suatu deretan (rantai) yang terlihat sebagai suatu garis
tebal dihitung sebagai satu koloni.
• Data yang dilaporkan harus mengikuti peraturan yaitu hanya terdiri
dari dua angka, yaitu angka pertama di depan koma dan angka ke dua
dibelakang koma.
• Jika semua pengenceran menghasilkan angka kurang dari 25 koloni,
hanya jumlah koloni yang terendah yang dihitung. Jika semua
pengenceran menghasilkan lebih dari 250 koloni pada cawan Petri,
hanya jumlah koloni pada pengenceran yang tertinggi yang dihitung.
• Jika terdapat lebih dari satu cawan yang mempunyai jumlah koloni
yang memenuhi syarat, maka dihitung nilai rata-ratanya.
• Contoh 1:
Pengenceran 1:100 jumlah koloni 243*
Pengenceran 1: 1000 jumlah koloni 23
Maka jumlah bakteri: 24.300 ditulis 2,4 X 104 cfu/ml
Perhitungan Bakteri
• Contoh 2
Pengenceran 1:100 jumlah koloni spreader
Pengenceran 1: 1000 jumlah koloni 31*
Maka jumlah bakteri: 31.000 ditulis 3,1 X 104 cfu/ml

• Contoh 3
Pengenceran 1:100 jumlah koloni 305
Pengenceran 1: 1000 jumlah koloni 42
Maka jumlah bakteri: 42.000 ditulis 4,2 X 104 cfu/ml
Jika dua pengenceran memenuhi syarat
• Contoh 4
Pengenceran 1:100 jumlah koloni 200*
Pengenceran 1: 1000 jumlah koloni 42*
1. Bandingkan dua pengenceran tersebut, jika < 2 maka
dirata-rata jika > 2 gunakan pengenceran yg lebih
kecil
Maka jumlah bakteri: 42.000/20.000 > 2 maka
jumlah bakteri = ditulis 2,0 X 103 cfu/ml
Perhitungan dengan 2 ulangan
• Contoh 5
Pengenceran Petri 1 Petri 2
10-2 175 208
10-3 16 17
Maka:
• Rata-rata terlebih dahulu padapengenceran yg
memenuhi syarat
• Yang memenuhi syarat hanya pengenceran 1:100
sehingga (175 + 208)/2 = 191,5
• Karena digit ketiga kurang dari 5 maka jumlah bakteri
adalah 19.000 cfu/g atau 1,9 X 104 cfu/ml
Syarat-syarat perhitungan
1. Jumlah koloni 25 – 250 dengan dua ulangan
Contoh 6:
Pengenceran Petri 1 Petri 2
10-2 228 240
10-3 28 23
Maka:
23 tidak memenuhi syarat tetapi krn 28 memenuhi syarat
maka tetap dirata-rata terlebih dahulu.
(280+230)/(228+240) = 510/468 < 2 maka
Jumlah sel = (280+230+228+240)/4 = 244,5 X102
= 2,5 X104 cfu/ml
Tidak ada petri dengan jumlah koloni antara 25 - 250
• Jika tidak ditemui petri dengan jumlah koloni antara 25
dan 250 dan salah satu petri memiliki jumlah koloni lebih
dari 250 maka pilih yang paling mendekati 250 dan
hitung sebagai hasil pendugaan (dugaan) cfu/g
• Contoh 7:
Pengenceran 1:100 jumlah koloni 325
Pengenceran 1:1000 jumlah koloni 20
maka jumlah mikroba adalah 33.000 (dug) cfu/g atau 3,3
X104 cfu/ml (est/dug)
Tidak ada petri dengan jumlah koloni antara 25 - 250

• Contoh 8:
Pengenceran 1:100 jumlah koloni 287 dan 263
Pengenceran 1;1000 jumlah koloni 23 dan 19
Yang dipakai adalah yang mendekati 250
(287+263)/2 = (550/2) = 27,5 karena desimal terakhir 5
maka menjadi 28
jadi jumlah mikroba = 28.000 cfu/g atau 2,8 X 104 cfu/ml
(est)
Semua petri dengan jumlah koloni kurang dari 25

• Jika petri dari semua pengenceran menunjukkan jumlah

koloni kurang dari 25, catat jumlah aktual koloni pada
pengenceran yang paling rendah dan laporkan sebagai
dugaan cfu/g
Contoh 9:
Pengenceran 1:100 jumlah koloni 0
Pengenceran 1:1000 jumlah koloni 0
maka jumlah mikroba adalah <100 (dug) cfu/g
Contoh 10:
Pengenceran 1:100 jumlah koloni 18 dan 16
Pengenceran 1:1000 jumlah koloni 2 dan 0
maka jumlah mikroba <1700 (dug) cfu/g.
Tidak ada koloni yang tumbuh.
• Jika pada semua pengenceran tidak dijumpai adanya
koloni dan tidak terdapat senyawa penghambat,
laporkan jumlah pendugaan dengan kurang dari (<) pada
pengenceran yang paling rendah.
Contoh 11:
Pengenceran 1:100 jumlah koloni 0
Pengenceran 1:1000 jumlah koloni 0.
Maka jumlah mikroba <100 (dug) cfu/g
TUGAS
1. Sampling dari tanah, udara, air, dan makanan
2. Hitung koloni bakteri dari isolate bakteri (gunakan teknik
pengenceran bertingkat)
Format Laporan
• BAB 1 : prosedur kerja (diagram)
• BAB 2: hasil pengamatan
• BAB 3 : Pembahasan