药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2014, 49 (1): 83 −88 · 83 ·
盐酸哌甲酯在血浆中的稳定性及其药动学研究
罗雪梅 1, 2, 丁 黎 2*, 顾 新 1*, 姜莉苑 2, 董 馨2
(1. 南京大学医学院附属鼓楼医院药学部, 江苏 南京 210008; 2. 中国药科大学药物分析教研室, 江苏 南京 210009)
摘要: 研究哌甲酯 (MPH) 在人血浆中不稳定性, 建立 HPLC-MS/MS 测定方法并运用于人体药代动力学研
究。采用 HPLC 及 LC-MS/MS 法考察哌甲酯在醇、水、血浆中的稳定性及甲酸水溶液处理对哌甲酯降解的抑制
作用。结果表明, 于新鲜制备的人血浆样品 (200 µL) 中立即加入 2% 甲酸水溶液 10 µL, 能够抑制血浆中血浆酯
酶的活性。以 5 mmol·L−1 醋酸铵水溶液 (含 0.1% 甲酸)−甲醇 (54∶46) 为流动相; 使用 Sapphire C 18 柱进行分离。
采用电喷雾离子源 (ESI+) 及多反应监测模式 (MRM) 进行检测, 检测离子为 m/z 234.2 → 84.1 (MPH), m/z 260.3 →
183.1 (普萘洛尔, 内标)。哌甲酯血浆浓度测定线性范围为 0.035～40 ng·mL−1; 日内、日间精密度 (RSD) 均小于
5%, 准确度为 ± 2% 之内。应用此法研究了 6 名健康志愿者单剂量口服哌甲酯 36 mg 后药动学特点。所建方法能
准确测定人血浆中哌甲酯的血药浓度, 可用于哌甲酯的人体药动学研究。
关键词: 哌甲酯; 稳定性; 药动学; LC-MS/MS; 水解
中图分类号: R917; R969 文献标识码: A 文章编号: 0513-4870 (2014) 01-0083-06
LC-MS/MS assay of methylphenidate: stability and
pharmacokinetics in human
LUO Xue-mei1, 2, DING Li2*, GU Xin1*, JIANG Li-yuan2, DONG Xin2
(1. Department of Medication, The Affiliated Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical School, Nanjing 210008, China;
2. Department of Pharmaceutical Analysis, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China )
Abstract: The study aims to solve the instability problem of methylphenidate (MPH) in plasma, and establish
a LC-MS/MS method for simultaneous determining of MPH in human plasma. The stabilities of MPH in different
media were studied, and the degradation characteristics of MPH in these media were also investigated by HPLC
and LC-MS/MS. To a 200 µL aliquot of freshly collected plasma sample, 10 µL 2% formic acid was added
immediately to prevent the hydrolysis of MPH in human plasma samples. Chromatographic separation was
performed on a Sapphire C 18 column using the mobile phase of methanol – 5 mmol·L−1 ammonium acetate buffer
solution containing 0.1% formic acid (46 ∶54). MPH was quantified by tandem mass spectrometry operating in
positive electrospray ionization mode with multiple reaction monitoring. The detection used the transitions of
protonated molecules at m/z 234.2 → 84.1 for MPH and m/z 260.3 → 183.1 for propranolol (IS), separately. The
intra- and inter-assay precisions were all below 5.0%. The accuracies were all in standard ranges. The linear
calibration curve was obtained in the concentration range of 0.035 −40 ng·mL−1. The methods fulfilled the
demand. The method was used to determine the concentration of MPH in human plasma after a single dose of
36 mg MPH tablet to 6 healthy Chinese volunteers. The method is suitable for the precisely determination
of MPH and for pharmacokinetic study of MPH in human plasma.
Key words: methylphenidate; stability; pharmacokinetics; LC-MS/MS; hydrolysis
收稿日期: 2013-07-04; 修回日期: 2013-08-16.
*通讯作者 Tel / Fax: 86-25-83271289, E-mail: dinglihg@sina.com
Tel / Fax: 86-25-83106666, E-mail: njglyygx@126.com
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盐酸哌甲酯 (methylphenidate, MPH), 俗称利他 碰撞能量 20 eV; 干燥气流速: 10 L·min−1; 雾化室压
林 (ritalin), 是一种人工合成中枢神经兴奋药, 化学结 力: 40 psig; 干燥气温度: 350 ℃。哌甲酯选择性检测
构与交感胺类药物苯丙胺相似, 主要用于治疗儿童注 质荷比为 m/z 234.2 → 84.1, 内标 (普萘洛尔) 为 m/z
意力缺陷多动障碍症 (attention-deficit hyperactivity 260.3 → 183.1。
[1]
disorder, ADHD) 。 血样处理 于 1.5 mL 离心管中精密加入血浆样
然而在人血浆中, 盐酸哌甲酯极不稳定, 会被血 品 200 μL, 2% 浓度甲酸水溶液 10 μL, 旋涡混匀, 再
浆酯酶快速代谢为哌醋甲酸 (ritalinic acid, RA) [2], 加入内标 (普萘洛尔) 对照品溶液 (2.505 μg·mL−1)
直接影响了人血浆中哌甲酯浓度的准确测定。国内外 20 μL, 旋涡混匀。加入甲醇 400 μL, 旋涡 2 min, 于
[2−14]
文献中, 血浆中哌甲酯测定前处理方法有许多 : 15 600 r·mL−1 高速离心 5 min, 吸取上清液 400 μL 转
如沉淀法[2]、液液萃取 (LLE)[3−6]、固相萃取 (SPE)[7, 8] 移至自动进样器样品瓶中, 进样 15 μL。
[9]
和衍生化 法。但是, 对哌甲酯在人血浆中的稳定性 稳定性考察
[4, 10]
研究尚未见文献报道。一些报道 提到在低温下快 相同条件下, 3 种溶剂不同放置时间的稳定性 分
速 (40～50 min) 制备哌甲酯血浆样品可以减缓其在 别配制质量浓度为 10 μg·mL−1 哌甲酯的甲醇、水及
血浆中的快速降解。但是, 因为血浆酯酶在低温 (如 血浆样品数份 (室温放置) , 于室温放置 0、1、2、4、
冰浴, 0 ℃ ) 条件下仍有活性, 那么这种方法就不可 6、12、16 和 20 h 后, 采用高效液相色谱仪进行检测。
能完全抑制血浆样品中哌甲酯的降解。不仅如此, 在 经甲酸或未经甲酸处理, 相同沉淀溶剂, 不同放置
[2]
样品反复冻融过程中, 降解情况也会发生 。因此, 时间的稳定性 配制哌甲酯质量浓度为 10 μg·mL−1
上述方法就很难满足药动学研究时常需要的高通量 的含药血浆样品 2 份, 并立即于样品 2 中加入适量
分析。本研究采用新的前处理方法, 很好地抑制了人 甲酸 (约 500 μL), 涡旋混匀。将两份样品 (样品 1 未
血浆中盐酸哌甲酯的降解, 并建立了串联质谱分析 经甲酸处理) 同条件下于室温放置。在 0、1、2、4、
方法。所建立的 LC-MS/MS 分析方法准确、灵敏、方 6、12、16 和 20 h 时间点时, 甲醇沉淀后 HPLC 检测。
便、耐用, 可用于盐酸哌甲酯的人体药动学研究。 与此同时, 两组 0 h 沉淀的样品的上清液于 6、12 和
24 h 分别再次重复进样。
材料与方法 采用 LC-MS/MS 法验证 配制数份含哌甲酯血
仪器与试药 Agilent 1100 液相色谱仪, 含双高 浆样品, 部分加入 2% 甲酸 10 μL 涡旋混匀。将血浆样
压泵、自动进样器、柱温箱、紫外检测器、色谱工作 品放置室温 12 h 后用 2 倍甲醇直接沉淀, 离心取上清
站 (Agilent Chemstation); Aglient 1200-6410B 液相 液进行 LC-MS/MS 分析。在 MRM 模式下, 同时监测
色谱−质谱联用仪, 配有双高压泵、自动进样器、电 哌甲酯 (234.2 → 84.1) 与哌醋甲酸 (220.2 → 84.1)。
喷雾离子化接口、三重四极质谱检测器及 Agilent 方法学考察
MassHunter 数据处理软件 (美国 Agilent 公司); 盐酸 特异性 分别取 6 个不同来源的空白血浆 200 μL,
哌甲酯对照品由国内某药厂提供 (规格: API)。 除不加内标外, 其余按“血样处理”项下操作, 进行
溶液的配制 精密称取盐酸哌甲酯 5.87 mg (相 LC-MS 分析, 得空白血浆样品色谱图; 将哌甲酯和
当于哌甲酯对照品 5.08 mg) 置于 10 mL 量瓶中, 加 内标 (普萘洛尔) 对照品溶液分别加入空白血浆后,
−1
甲醇溶解并稀释至刻度, 摇匀, 配制成 508 μg·mL 同法操作, 得血浆样品色谱图; 取健康受试者给药后
哌甲酯储备液。精密称取盐酸普萘洛尔 5.71 mg (相 收集的血浆样品, 同法操作, 得健康受试者血浆样品
当于普萘洛尔对照品 5.01 mg), 置于 10 mL 量瓶中, 色谱图。
加入甲醇溶解并稀释至刻度, 摇匀, 配制成质量浓度 Carry-over 效应 以标准曲线最高浓度点 (40
−1 −1
为 501 μg·mL 的普萘洛尔储备液。 置于 4 ℃保存。 ng·mL ) 与空白血浆样品为一组, 连续进样 5 组, 考
色谱条件 采用色谱柱 Sapphire C 18 (150 mm × 察样品与内标的残留效应 (carry-over 效应)。残留效
2.1 mm ID, 5 μm, Sepax Tech.); 柱温 38 ℃; 流动相: 应判定标准为: 于空白血浆样品中, 样品保留时间处
−1
5 mmol·L 醋酸铵水溶液 (含 0.1% 甲酸)−甲醇 (54∶ 干扰杂质的峰面积 (As) 小于定量下限 (LLOQ) 的
−1
46), 流速 0.35 mL·min , 进样量 15 μL。 20%, 内标保留时间处干扰杂质的峰面积 (A′s) 小于
+
质谱条件 采用电喷雾电离源正离子模式 (ESI ), 内标的 5%。
离子检测方式为多重反应监测 (MRM); 裂解电压 95 V, 标准曲线制备及定量下限 取 1.5 mL 离心管数
罗雪梅等: 盐酸哌甲酯在血浆中的稳定性及其药动学研究 · 85 ·
支, 分别精密加入不同量的哌甲酯对照品溶液, 以氮 常。实验前两周及实验期间未服用其他任何药物, 均
气流吹干, 加入空白血浆 200 μL, 旋涡混匀, 配制成 签署知情同意书。试验期间统一饮食。按试验方案
哌甲酯质量浓度分别为 0.035 56、0.101 6、0.304 8、 试验受试者经筛选入组后, 给予专注达 (Concerta ®
−1
1.016、3.048、10.16、20.32 和 40.64 ng·mL 的含药 36 mg/片) 一片单次口服给药。于服药前一天 21∶00
血浆, 按“血样处理”项下操作, 并同时制备空白血 以后开始禁食; 第二天早上 6∶40 采集给药前的空白
浆样品, 进行 LC-MS/MS 分析, 记录色谱图, 制备标 血样, 并在给药前统一进食高脂标准餐, 7 ∶00 在医
准曲线。 生指导下给药一片 (粒), 用 240 mL 水送服药物并经
精密度与准确度 配制含哌甲酯质量浓度分别 口腔检查确认, 在给药后 0.5、1、1.5、2、3、4、5、
−1
为 0.101 6、2.032 和 35.56 ng·mL 的含药血浆, 每个 6、8、10、12、16、20、24 和 36 h 采集血样 (共 15
浓度各配制 5 份样品, 按“血样处理”项下操作, 计 次, 每次 4 mL)。采集的血样立即移至肝素抗凝管中,
算样品和内标峰面积的比值 f 。将 f 代入随行标准曲 摇匀, 4 000 r·min−1 离心 5 min 取血浆, 一式两份, 每
线方程, 计算各样品浓度。连续测定 3 批样品, 根据 份 1 mL, 加入 50 µL 的 2% 甲酸水溶液, 涡旋混匀,
样品浓度, 计算准确度与精密度。 −30 ℃保存, 供血药浓度测定用。
基质效应、提取回收率、精密度与准确度 按文
[15]
献 方法考察基质效应 (ME) 和提取回收率, 配制并
结果与讨论
处理哌甲酯质量浓度分别为 0.101 6、2.032 和 35.56
1 稳定性考察及前处理方法的选择
ng·mL−1 的含药血浆, 每个浓度平行 5 份, 作为回收
1.1 相同条件下, 3 种溶剂不同放置时间的稳定性
率样品; 另取 5 个不同来源空白血浆同法处理, 取上
结果表明: 哌甲酯在甲醇中放置 24 h 未见降解 (图
清液, 加入哌甲酯和内标溶液, 配制同上 3 个质量浓
1, n = 3, RSD < 5.1)。在水中降解相对缓慢, 24 h 内降
度的含药血浆, 每个浓度平行 5 份, 作为基质效应样
解近 10% 。
品和回收率对照样品; 以水代替血浆同法配制并处
理同上 3 个质量浓度的溶液, 每个浓度平行 3 份, 作
为基质效应对照样品。将上述样品进样, 记录色谱图,
回收率和基质效应样品峰面积与相应对照品峰面积
均值之比即为回收率和基质效应值。再配制上述等浓
度含药血浆, 每个浓度各配制 5 份样品, 按“血样处
理”项下操作, 计算样品和内标峰面积的比值 f 。将
f 代入随行标准曲线方程, 计算各样品浓度。连续测
定 3 批样品, 根据样品浓度, 计算准确度与精密度。
稳定性 配制哌甲酯质量浓度分别为 0.101 6、
2.032 和 35.56 ng·mL−1 的含药血浆, 低、中、高 3 个
浓度的样品数份, 按“血样处理”项下操作后立即
Figure 1 The degradation profiles of methylphenidate (MPH)
进行 LC-MS/MS 分析或于进样器放置 8.5 h 后再进行
at concentration level of 10 µg·mL−1 in methanol (M), water and
检测; 另取 3 份室温放置 7.5 h, 3 份反复冻融 3 次, plasma, separately, at room temperature
然后将这 6 份血样同法处理、测定。
药代动力学研究 由于哌甲酯缓释制剂的主要 1.2 经甲酸或未经甲酸处理, 相同沉淀溶剂, 不同
目标人群为儿童, 考虑到儿童用药有可能受到饮食 放置时间的稳定性 结果表明: 样品 1 仍然降解迅
特点的影响, 本试验特考察健康受试者给予高脂标 速, 5 h 降解 30%, 24 h 内降解 50% (图 2a, RSD <
准餐后的药代动力学研究。高脂标准餐: 包括一个含 4.8%)。但经甲酸处理后的血浆 (样品 2), 未发现明
奶油的面包、一个煎蛋、一片奶酪、一片培根、一份 显降解 (图 2a)。不仅如此, 经甲醇沉淀后, 未加甲
100 克炸薯饼及 200 mL 全脂牛奶。 酸处理的血浆样品与加甲酸处理后的血浆样品上清
6 名男性健康受试者, 体重 50.0～70.5 kg, 年龄 液 (未发现明显降解) 相比, 仍有微弱的降解 (图 2b,
20～28 岁, 经体检证明肝、肾功能正常, 心电图正 RSD < 4.0%), 这与水 20 h 降解的程度相似。此时,
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在新制血浆中立即加入一定量的甲酸水溶液以保证
哌甲酯的稳定性。在进行哌甲酯的血药浓度测定时,
应注意血浆样品的处理和保存方式。
2 方法学考察
2.1 特异性 由图 4 可见, 盐酸哌甲酯、内标峰形
良好, 内源性物质无干扰, 保留时间分别为 2.0 和 4.3
min。本方法具有较高的特异性, 能准确测定血浆中
哌甲酯的浓度, 且灵敏度较高。
2.2 Carry-over 效应 结果显示, 样品与内标保留时
间处均未出现干扰杂质的峰, 本次实验无残留效应。
2.3 标准曲线制备及定量下限 哌甲酯的回归方程:
−3 −2
f = 4.239×10 x + 6.828×10 (r = 0.998 3), 权重系数
w = 1/p , 最低定量限为35.56 pg·mL−1, 准确度为100.5%
2
(n = 6), 精密度为 2.9%。
2.4 基质效应、提取回收率、精密度与准确度试验
测得血浆中哌甲酯回收率及 ME 见表 1, 血浆中内标
普萘洛尔的回收率为 (97.0 ± 3.7) % (n = 15), 基质效
应为 (105.2 ± 2.4) % (n = 15), 结果表明本实验条件下
Figure 2 The degradation characteristics of MPH in human 哌甲酯和内标的回收率均良好, 血浆基质对其离子
plasma (a) of the Set 1 (treated without acid) and the Set 2
化及测定无影响。表 1 表明, 批内批间精密度 RSD 均
(treated with acid). The residual amounts of MPH (b) in the
supernatant of the two sets in the following hours. n = 3, x ± s 小于 15%, 符合生物药品分析测试要求。
2.5 稳定性 血浆中哌甲酯在不同处理条件的稳定
血浆酯酶应已被 2 倍体积的甲醇沉淀剂破坏失活, 推 性考察结果见表 2。结果显示, 在新鲜血浆中加入一
断有可能是加入的甲酸有微弱的抑制哌甲酯与哌醋
甲酸之间化学平衡转化的作用。 Table 1 Precision, accuracy and recovery and matrix effects for
the method. n = 5, x ± s
1.3 采用 LC-MS/MS 法验证 LC-MS/MS 对处理好
的样品分析后结果见图 3。结果证实, 未加甲酸处理 C/ng·mL−1
RSD/%
RE/%
Recovery Matrix
/% effect/%
的哌甲酯血浆样品中, 哌甲酯大量转化为哌醋甲酸 Intra-day Inter-day
(保留时间为 5.2 min), 而立即加甲酸处理后的哌甲 0.101 6 6.1 8.0 98.3 ± 4.2 107.3 ± 9.5 103.2 ± 3.1
2.032 4.1 5.8 99.8 ± 1.8 97.2 ± 3.5 96.7 ± 0.6
酯血浆样品中, 哌醋甲酸处几乎无峰。
35.56 4.8 6.1 100.7 ± 1.4 96.9 ± 3.0 97.4 ± 1.2
综上, 室温条件下哌甲酯在血浆中降解迅速, 可
Figure 3 Stabilities of MPH in different conditions tested by LC-MS/MS drug-free plasma (a), MPH plasma samples without acid
added (b), and plasma samples with acid (c)
罗雪梅等: 盐酸哌甲酯在血浆中的稳定性及其药动学研究 · 87 ·
Figure 4 MRM chromatograms for drug-free plasma (A), human plasma (200 μL) spiked with 10 µg·mL−1 of MPH and 100 ng·mL−1 IS
(B), and plasma sample 3.0 h after oral administration of 36 mg MPH (C)
Table 2 Stability of MPH in plasma at three QC levels. n=3
Freshly-prepared Short-term (7.5 h) Post-preparative (8.5 h) Freeze/thaw
Storage condition
Mean RE/% Mean RE/% Mean RE/% Mean RE/%
−1
C/ng·mL 0.101 6 0.103 6 2.0 0.096 87 −4.7 0.102 0 0.4 0.095 45 −6.1
2.032 1.981 −2.5 1.841 −9.4 1.846 −9.1 1.916 −5.7
35.56 36.71 3.2 34.07 −4.2 35.77 0.6 35.11 −1.3
定量的甲酸溶液, 哌甲酯稳定性良好。
3 药代动力学参数
血药浓度−时间曲线如图 5 所示, 采用 DAS 2.0
数据处理软件计算主要药动学参数结果为: 哌甲酯
t1/2 为 (4.3 ± 1.0) h, AUC 0−36 h 为 (89.2 ± 12.8) ng∙h·mL−1,
AUC0−∞为 (89.6 ± 12.9) ng∙h·mL−1, tmax 和 Cmax 分别为
(6.8 ± 1.3) h 和 (8.3 ± 1.5) ng·mL−1; CL 为 (407.9 ± 48.5)
L·h−1 。该血浆中哌甲酯缓释片药代动力学参数与国
外报道的无明显差别。
Figure 5 Mean plasma concentration-time profile of MPH in
结论 six Chinese volunteers after oral administration of a sustained-
哌甲酯在血浆中羧酸酯水解酶 1 (hCES1)[2]的作用 release (SR) tablet (36 mg/Tab, Concerta ®)
下会发生快速的降解, 转化成哌醋甲酸。有文献[16, 17]
报道, 甲酸可以有效抑制血浆中羧酸酯水解酶 1。稳 甲酯在血浆中的不稳定性。制备样品时, 血浆样品经
定性考察结果表明, 加入甲酸可有效抑制血浆中哌 两倍体积甲醇沉淀, 离心取上清液后进样进行 LC-
甲酯的快速降解, 且在一定程度上抑制哌甲酯与哌 MS/MS 分析。该样品分析方法简便易操作, 每个样
醋甲酸之间的化学平衡转换。另外, 由于①在未经处 品分析时间控制在 6 min, 极大提高了测定的效率,
理的血浆样品的运输、储存及反复冻融过程中可能还 适宜高通量分析。
存在微弱的血浆酯酶的活性; ②全血中直接加入甲酸 药动学研究中采用高脂饮食餐后给药, 是由于
有可能致使血细胞破裂, 产生溶血现象, 而使哌甲酯 药物主要目标人群为儿童, 儿童在早餐中接触高脂
在血浆样品中的浓度测定受到影响。因此, 最终采取 饮食 (如鸡蛋、牛奶等) 比一般人群的可能性及比例
在全血制成血浆后立即加入甲酸, 然后立即冷冻保 高。已有文献[18, 19]报道哌甲酯与高脂饮食之间的研究,
存血浆样品, 直至分析测定。 虽然研究结果为高脂饮食对哌甲酯体内药动学影响
本研究采用的向新鲜配制的血浆样品中加入 5% 不大, 但综合考虑, 本次试验方案最终选择为统一的
体积的 2% 甲酸水溶液的前处理方式, 较好抑制了哌 高脂饮食。
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