Novel protocol for the transcriptomic analysis of endothelial extracellular vesicles in atherosclerosis

• Autores: Goren Saenz Pipaona, Ana Cenarro, Jon Zazpe, Miriam Goñi Oloriz, Esther Martínez Aguilar, Florencio J.D. Machadoa, Francesco P. Marchese, Josune Orbea, Natalia López Andrés, Fernando Civeira Murillo, Jose A. Paramoa, David Lara Astiasok, Carmen Roncal
• Localización: Clínica e investigación en arteriosclerosis, ISSN 0214-9168, ISSN-e 1578-1879, Vol. 36, Nº. 6, 2024, págs. 343-345
• Idioma: inglés
• Títulos paralelos:
  • Nuevo protocolo para el análisis transcriptómico de las vesículas extracelulares endoteliales en aterosclerosis
• Enlaces
  • Texto completo
• Resumen
  • español

    Introducción: A pesar del papel clave del endotelio en la aterosclerosis, no existen técnicas directas para su análisis. El estudio de las vesículas extracelulares de origen endotelial (EEV) podría facilitar la identificación de firmas moleculares y biomarcadores tempranos de aterosclerosis. El objetivo de este trabajo fue establecer los métodos para la separación de EEV y suanálisis transcriptómico.Métodos: Adaptamos un protocolo de inmunocaptura con anticuerpos y microesferas magnéticas para la separación de las EEV del plasma de sujetos control (G1), con aterosclerosissubclínica (G2) y con enfermedad arterial periférica (G3), y modificamos un método de RNASeqpara su análisis transcriptómico (n = 5/grupo). Comparamos el transcriptoma de las EEV plasmáticas con el de células endoteliales de aorta humana (TeloHAEC) e identificamos genesdiferencialmente expresados (DEG) entre los grupos de pacientes, incluyendo UCP2, validadoen EV plasmáticas (qPCR) e in vitro, en TeloHAECs tratadas con IL-1, TNF-, oxLDL e hipoxia.Resultados: El RNASeq de las EEV plasmáticas detectó 1.667 genes enriquecidos en transcritos expresados por las TeloHAECs (NES: 1,93, ajuste p = 1,4e−73). Se identificaron 170 DEG entre losgrupos G2 vs. G1 y 180 entre G3 vs. G1, de los cuales 17 se expresaron de forma similar en G2 yG3 vs. control, incluyendo UCP2. El tratamiento con IL-1 y TNF- (10 ng/ml, p < 0,05), hipoxia(1% O2, p = 0,05) y oxLDL (100 g/ml, p = 0,055) redujo la expresión de UCP2 en las TeloHAEC.Conclusiones: Hemos puesto a punto un protocolo para la separación y la secuenciación de EEV que podría ser útil para la identificación de marcadores tempranos de disfunción endotelial en aterosclerosis

  • English

    Introduction: Despite the key role of the endothelium in atherosclerosis, there are no direct techniques for its analysis. The study of extracellular vesicles of endothelial origin (EEVs), might lead to the identification of molecular signatures and early biomarkers of atherosclerosis. The aim of this work was to set up the methods for EEVs separation and transcriptomic analysis.

    Methods: We adapted an antibody-magnetic-bead based immunocapture protocol for plasma EEVs separation from control (G1), subclinical atherosclerosis (G2) and peripheral artery disease subjects (PAD) (G3), and modified an ultra-low input RNASeq method (n = 5/group). By bioinformatics analysis we compared the transcriptome of plasma EEVs with that of human aortic endothelial cells (TeloHAECs), and then, searched for differentially expressed genes (DEG) among EEVs of G1, G2 and G3. From those DEG, UCP2 was selected for further validation in plasma EVs (qPCR), and in vitro, in stimulated TeloHAECs (IL-1, TNF, oxLDL and hypoxia).