A pintura retrata a história do evangelho de Mateus 9:9, "Passando por ali, Jesus viu um homem chamado Mateus, sentado no posto de cobrança, e disse-lhe: 'Segue-me'. Mateus levantou-se e seguiu-o." Caravaggio retrata Mateus, o cobrador de impostos, sentado na mesa com outros quatro homens. Jesus Cristo e São Pedro entraram na sala, e Jesus está a apontar para Mateus. Um raio de luz ilumina as faces dos homens na mesa que estão a olhar para Jesus.