아가로세

Agarose
겔 전기영양에 사용되는 트레이의 아가로스 젤

아가로스는 다당류로, 일반적으로 특정 붉은 해초에서 추출된다.[1] D-갈락토스와 3,6-안하이드로-L-갈락토피라노스로 구성된 이당류인 아가로바이오소스의 반복단위로 구성된 선형중합체다.[2] 아가로스는 아가르의 두 가지 주요 성분 중 하나로 아가르의 다른 성분인 아가로펙틴을 제거하여 아가르에서 정제된다.[3]

아가로스는 분자생물학에서 전기영양증에 의한 큰 분자, 특히 DNA의 분리를 위해 자주 사용된다. 전기영양용 한가로스겔 슬래브(보통 0.7~2%)는 따뜻한 액체 용액을 틀에 부어 쉽게 준비한다. 이러한 목적을 위해 다양한 분자량 및 성질의 다양한 농도를 상업적으로 이용할 수 있다. 아가로스는 또한 구슬로 형성되어 단백질 정화를 위한 많은 크로마토그래피 방법에 사용될 수 있다.

구조

Agarose 중합체의 반복 단위 구조.

아가로스는 분자중량이 약 12만인 선형 고분자로, α-(1→3)와 β-(1→4) 글리코시드 결합으로 연결된 D-갈락토스와 3,6-안하이드로-L-갈락토피라노스로 구성된다. 3,6-안하이드로-L-갈락토피라노스는 중합체의 일부 L-갈락토스 단위는 다리를 포함하지 않을 수 있지만, 3-6 위치 사이에 무하이드로 다리를 가진 L-갈락토스다. 일부 D-갈락토스와 L-갈락토오스 단위는 메틸화가 가능하며, 피루브산염과 황산염도 소량 검출된다.[4]

각 아가로오스 사슬에는 갈락토오스 분자가 800개까지 들어 있으며 아가로오스 폴리머 사슬은 반경 20~30nm의 슈퍼코일 구조로 집적되는 나선섬유를 형성한다.[5] 섬유는 준강성으로, 농약 농도에 따라 길이 범위가 넓다.[6] 섬유는 응고 시 사용된 아가로스의 농도에 따라 50 nm에서 200 nm 이하의 직경 채널의 3차원 메쉬를 형성하며, 농도가 높을수록 평균 공극 직경이 낮아진다. 3-D 구조는 수소 결합과 함께 고정되므로 액체 상태로 다시 가열하면 장애가 발생할 수 있다.

특성.

아가로스는 끓는 물에 용해되는 흰 가루로 사용 가능하며, 차가워지면 젤을 형성한다. 아가로스는 액체에서 젤로의 전환에서 열성 이력현상을 보인다. 즉, 아가로스는 다른 온도에서 녹고 녹는다. 겔링과 용해 온도는 아가로스의 종류에 따라 다르다. Standard agaroses derived from Gelidium has a gelling temperature of 34–38 °C (93–100 °F) and a melting temperature of 90–95 °C (194–203 °F), while those derived from Gracilaria, due to its higher methoxy substituents, has a gelling temperature of 40–52 °C (104–126 °F) and melting temperature of 85–90 °C (185–194 °F).[7] 용해 및 겔링 온도는 특히 1% 미만의 낮은 겔 농도에서 젤의 농도에 따라 달라질 수 있다. 따라서 겔링 및 용해 온도는 지정된 농도의 농도로 주어진다.

천연 아가로오스에는 무충전 메틸군이 함유되어 있으며 메틸화의 정도는 겔링 온도에 정비례한다. 그러나 합성 메틸화는 역효과를 내는데, 메틸화의 증가로 겔링 온도가 낮아진다.[8] 용해 및 겔링 온도가 서로 다른 다양한 화학적으로 변형된 용해물을 화학적 변형을 통해 이용할 수 있다.

겔 속 아가로스는 모공을 함유한 메쉬워크를 형성하며, 모공의 크기는 아가로오스 농도에 따라 달라진다. 서 있을 때 아가로스겔은 시네레시스(젤 표면을 통한 물의 분출)에 잘 걸리지만, 그 과정은 젤의 사용에 지장을 주지 않을 정도로 느리다.[9][10]

아가로오스 젤은 낮은 농도에서 높은 젤 강도를 가질 수 있어 젤 전기적 색소에 대한 항응성 매개체로 적합하다. 0.15%만큼 희석된 아가로스겔은 젤 전기영동증에 대한 슬래브를 형성할 수 있다.[11] 아가로스 중합체는 특히 화농산염과 황산염을 포함한 전하를 띤 그룹을 포함한다.[8] 이러한 음전하 그룹은 EEO라고 불리는 과정에서 DNA 분자의 움직임을 느리게 할 수 있으며, 따라서 낮은 EEO 아가로스는 일반적으로 핵산의 아가로오스겔 전기영양증에 사용하기 위해 선호된다. 제로 EEO 활성제도 이용할 수 있지만, 이는 후속 효소 반응에 영향을 줄 수 있는 양전하 그룹을 추가함으로써 이루어질 수 있기 때문에 일부 용도에서는 바람직하지 않을 수 있다.[12] 한지의 한가로펙틴이 상당량의 음전하 황산염과 카르복실군을 함유하고 있어 한가로스가 한가로스보다 우선적으로 사용되는 이유다. 한천에서 아가로펙틴을 제거하면 EEO를 상당히 감소시킬 뿐만 아니라 젤 매트릭스에 대한 생체 분자의 비특이 흡착도 감소한다. 단, 혈청 단백질의 전기영양과 같은 일부 용도의 경우 높은 EEO가 바람직할 수 있으며, 사용하는 젤에 아가로펙틴이 첨가될 수 있다.[13]

용해 및 겔링 온도가 낮음

아가로스의 용해 및 겔링 온도는 화학적 개조에 의해 수정될 수 있는데, 가장 일반적으로 히드록시틸화에 의해 주내 수소 결합의 수가 감소하여 표준 아가로제보다 용해 및 설정 온도가 낮아진다.[14] 정확한 온도는 치환 정도에 의해 결정되며, 많은 사용 가능한 저융점(LMP) 용해제는 30–35°C(86–95°F) 범위에서 유체를 유지할 수 있다. 이 성질은 DNA 젤 전기영동 후 반응 혼합물에 관심 있는 DNA 파편을 함유한 녹인 젤 조각들을 첨가하여 효소 조작을 직접 수행할 수 있게 한다. LMP Agarose는 일부 효소 반응에 영향을 미칠 수 있는 황산염을 적게 함유하고 있으므로 일부 용도에 사용하는 것이 바람직하다. 히드록시 에틸화는 아가로스 다발의 패킹 밀도를 줄여 모공 크기를 줄일 수 있으므로 LMP 젤은 전기영동시 시간과 분리에도 영향을 미칠 수 있다.[15] 초저온 용해 또는 겔링 온도 아가로스는 8–15°C(46–59°F)에서만 젤을 겔로 만들 수 있다.

적용들

에티듐 브롬화물로 얼룩진 DNA 띠를 가진 아가로스 젤로, UV 트랜스틸루미네이터에 자외선을 받아 시각화된다.

아가로스는 물리적, 화학적, 열적 안정성의 범위가 넓어 단백질과 핵산과의 작업에 선호되는 기질이며, 화학적 복잡성이 낮기 때문에 생체분자와 상호작용할 가능성도 낮다. 아가로스는 아가로오스겔 전기영동체에서 분석 스케일 전기영동 분리의 매개체로 가장 많이 사용된다. 정제된 아가로스로 만든 겔은 모공 크기가 비교적 커서 단백질과 단백질 복합체 200킬로달톤 이하, DNA 파편 > 100 베이스페어 이하 등 큰 분자의 분리에 유용하다. 아가로스는 또한 아가로오스 섬유가 면역 복합체의 닻 역할을 하기 때문에 면역 억제와 면역 전기로와 같은 많은 다른 용도에 널리 사용된다.

아가로오스겔전기영양증

주요 기사: 아가로오스겔전기영양증

아가로오스겔 전기영양증은 실험실에서 DNA를 해결하기 위한 일상적인 방법이다. 아가로스겔은 아크릴아미드겔에 비해 DNA의 분해능력은 낮지만 분리범위가 더 넓어 펄스장겔전기영양증(PFGE)으로 6Mb 이상의 분해능이 가능하지만 보통 50~2만bp(베이스페어) 길이의 DNA 조각에 사용된다.[16] 또한 큰 단백질 분자를 분리하는 데도 사용할 수 있으며, 유효 반경이 5-10nm 이상인 입자의 젤 전기영양에 선호되는 매트릭스다.[11]

젤의 모공 크기는 체에 넣을 수 있는 DNA의 크기에 영향을 미친다. 젤의 농도가 낮을수록 모공 크기가 커지며 체에 넣을 수 있는 DNA가 커진다. 그러나 저농도 겔(0.1~0.2%)은 연약해 다루기 어렵고, 큰 DNA 분자의 전기영양도 며칠이 걸릴 수 있다. 표준 아가로스겔 전기영양증에 대한 분해능의 한계는 약 750kb이다.[16] 이 한계는 PFGE에 의해 극복될 수 있으며, 여기서 겔에 교대로 직교 전기장이 적용된다. DNA 조각은 적용된 장이 방향을 바꿀 때 방향을 바꾸지만, DNA의 큰 분자는 전기장이 바뀔 때 스스로를 재정렬하는 데 더 오랜 시간이 걸리는 반면, 작은 분자는 더 빠르고, 따라서 크기에 따라 DNA를 분할할 수 있다.

아가로스겔은 틀에 주조되며, 세팅하면 보통 완충용액에서 수평으로 물에 잠기게 된다. 트리스-아세트산-EDTA 및 트리스-보레이트-EDTA 버퍼가 일반적으로 사용되지만, 트리스-인산염, 바비투르산-소듐 바비투르산염 또는 트리스-바비투르산 버퍼와 같은 다른 버퍼가 다른 애플리케이션에서 사용될 수 있다.[1] DNA는 보통 에티듐브로마이드로 얼룩을 낸 다음 UV광 아래에서 보지만 SYBR Green, GelRed, Methylene Blue, 크리스탈 바이올렛과 같은 다른 얼룩 방법을 사용할 수 있다. 추가 다운스트림 실험을 위해 분리된 DNA 조각이 필요할 경우, 추가 조작을 위해 젤을 조각으로 잘라낼 수 있다.

AKTA FPLC 기계의 단백질 정화에 사용되는 아가로오스 기반 젤 여과기둥.

단백질정화

아가로오스 젤 매트릭스는 예를 들어 젤 여과 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피에서와 같이 기둥 기반의 준비 스케일 분리에서 단백질 정화에 종종 사용된다. 그러나 연속 젤로는 사용되지 않고, 오히려 다공성 구슬이나 다양한 순도의 수지로 형성된다.[17] 구슬은 다공성이 강해 단백질이 구슬을 통해 자유롭게 흐를 수 있다. 이러한 아가로오스 기반 구슬은 일반적으로 부드럽고 쉽게 으스러지기 때문에 중력 흐름, 저속 원심분리 또는 저압 절차로 사용해야 한다.[18] 레진의 강도는 Agarose 레진의 교차 링크 증가와 화학적 강화에 의해 개선될 수 있지만, 그러한 변화는 친화 크로마토그래피와 같은 일부 분리 절차에서 단백질에 대한 결합 용량을 낮출 수도 있다.

아가로스는 생체 분자를 어느 정도 흡수하지 않고 흐름 특성이 양호하며 pH와 이온 강도의 극한은 물론 8M 요소나 6M 구아니딘 HCl 등 고농축 불포화물을 견딜 수 있어 크로마토그래피에 유용한 물질이다.[19] 젤 여과 크로마토그래피를 위한 한천 기반 매트릭스의 예로는 세파로스와 워크비즈 40SEC(크로스 링크 비로드 아가로즈), 프레이스토와 슈퍼로스(고도로 교차 링크된 비로드 아가로즈), 슈퍼덱스(아그로스와 공동 링크된 덱스트란)가 있다.

친화력 크로마토그래피의 경우, 비로드 아가로스는 단백질을 결합하는 리간드를 부착하는 데 가장 흔히 사용되는 매트릭스 수지다.[20] 리간드는 아가로스 비드 폴리머의 활성 히드록실 그룹과 스페이서를 통해 공동 연결된다. 관심 있는 단백질은 리간드에 선택적으로 결합되어 다른 단백질과 분리될 수 있으며, 그 후에는 용출될 수 있다. 사용되는 한천구슬은 일반적으로 4%와 6%의 밀도로 단백질 결합 능력이 높다.

고체배양매체

아가로스 판은 유기체를 배양하기 위해 아가르 대신 가끔 사용될 수 있다. 아가르는 유기체의 성장에 영향을 줄 수 있는 불순물 또는 PCR과 같은 일부 다운스트림 절차를 포함할 수 있기 때문이다. 아가로스는 또한 아가르보다 단단하며 따라서 젤 강도가 더 필요한 경우에 더 좋을 수 있으며, 아가로스의 낮은 겔링 온도는 겔링 전 세포가 액체로 매달려 있을 때 유기체에 열 충격을 주지 않을 수 있다. 그것은 엄격한 자생성 박테리아, 식물 원생동물,[21] 선충,[22] 다른 유기체 및 다양한 세포의 배양에 사용될 수 있다.

운동성 어세이

아가로스는 미생물의 운동성과 이동성을 측정하기 위해 아가로 대신 사용되기도 한다. 운동성 종은 비록 느리지만, 다공성 젤을 통해 이동될 수 있을 것이고, 그러면 침투율이 가시화될 수 있을 것이다. 겔의 다공성은 중간의 아가르 또는 아가로스의 농도와 직결되기 때문에, 서로 다른 농도 겔을 사용하여 세포의 수영, 우글거림, 미끄러짐 및 경련 운동성을 평가할 수 있다. 화학적 축과 화학적 요인을 측정하기 위해 아가로스 세포 이동 검사를 사용할 수 있다. 한 층의 아가로스 젤을 세포군과 화학 반응제 사이에 놓는다. 농도 구배는 화학 물질을 겔로 확산시키는 것에서 발전하므로, 서로 다른 자극 수준이 이동해야 하는 다양한 세포군은 그 구배를 따라 중력에 대항하여 젤을 통해 위쪽으로 터널을 통과하면서 마이크로소그래피를 사용하여 시간이 지남에 따라 시각화할 수 있다.

참고 항목

참조

  1. ^ a b Jeppsson JO, Laurell CB, Franzén B (April 1979). "Agarose gel electrophoresis". Clinical Chemistry. 25 (4): 629–38. doi:10.1093/clinchem/25.4.629. PMID 313856.
  2. ^ Agar 2007년 10월 16일 Wayback Machine에 보관된 lsbu.ac.uk Water Structure and Science
  3. ^ "Agar". Food and Agricultural Organization of the United Nations.
  4. ^ Armisen R, Galatas F. "Chapter 1 - Production, Properties and Uses of Agar". Fao.org.
  5. ^ Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J (1982). "Chapter 5, protocol 1". Molecular Cloning - A Laboratory Manual. Vol. 1. p. 5.4. ISBN 978-0879691363.
  6. ^ Stephen AM, Phillips GO, eds. (2006). Food Polysaccharides and Their Applications. CRC Press. p. 226. ISBN 978-0824759223.
  7. ^ Workshop on Marine Algae Biotechnology: Summary Report. National Academy Press. 1986. p. 25.
  8. ^ a b "Appendix B: Agarose Physical Chemistry" (PDF). Lonza Group.
  9. ^ Hill SE, Ledward DA, Mitchell JR, eds. (1998). Functional Properties of Food Macromolecules. Springer. p. 149. ISBN 978-0-7514-0421-0.
  10. ^ Park H, Park K, Shalaby WS (1993). Biodegradable Hydrogels for Drug Delivery. CRC Press. p. 102. ISBN 978-1566760041.
  11. ^ a b Serwer P (1983). "Agarose gels: Properties and use for electrophoresis". Electrophoresis. 4 (6): 375–382. doi:10.1002/elps.1150040602. S2CID 97819634.
  12. ^ Sambrook J, Russell D. "Chapter 5, protocol 1". Molecular Cloning - A Laboratory Manual. Vol. 1 (3rd ed.). p. 5.7. ISBN 978-0-87969-577-4.
  13. ^ Keren D (26 September 2003). Protein Electrophoresis in Clinical Diagnosis. CRC Press. pp. 7–8. ISBN 978-0340812136.
  14. ^ Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J. "Chapter 5, protocol 6". Molecular Cloning - A Laboratory Manual. Vol. 1. p. 5.29. ISBN 978-0879695774.
  15. ^ Lee PY, Costumbrado J, Hsu CY, Kim YH (April 2012). "Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments". Journal of Visualized Experiments. 62 (62): 3923. doi:10.3791/3923. PMC 4846332. PMID 22546956.
  16. ^ a b Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J (1982). "Chapter 5, protocol 1". Molecular Cloning - A Laboratory Manual. Vol. 1. p. 5.2–5.3. ISBN 978-0879691363.
  17. ^ Freifelder D (1982). Physical Biochemistry: Applications to Biochemistry and Molecular Biology (2nd ed.). WH Freeman. p. 240. ISBN 978-0716714446.
  18. ^ "Overview of Affinity Purification". Thermo Scientific.
  19. ^ Freifelder D (1982). Physical Biochemistry: Applications to Biochemistry and Molecular Biology (2nd ed.). WH Freeman. p. 258. ISBN 978-0716714446.
  20. ^ Cuatrecasas P, Wilchek M (2004). Lennarz WJ, Lane MD (eds.). Encyclopedia of Biological Chemistry. Vol. 1. Academic Press. p. 52. ISBN 9780124437104.
  21. ^ Bonga JM, von Aderkas P (1992). In Vitro Culture of Trees. Springer. p. 16. ISBN 978-0792315407.
  22. ^ Caldwell GA, Williams SN, Caldwell KA (2006). Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. Wiley. pp. 94–95. ISBN 978-0470095027.