CyTOF

CyTOF

CyTOF(Cytometry by flight of flight), 즉 CyTOF는 단일 세포의 표면과 내부에 라벨이 부착된 표적을 정량화하는 데 사용되는 질량 세포 측정의 응용 프로그램이다.CyTOF를 사용하면 ICP-MS 검출기를 사용하여 여러 셀 구성 요소를 동시에 정량화할 수 있습니다.

CyTOF는 면역라벨링을 이용하여 세포 내 단백질, 탄수화물 또는 지질 등을 정량화합니다.특정 연구 질문에 답변하기 위해 대상이 선택되고 란타니드 금속 태그 항체로 레이블이 지정됩니다.라벨이 부착된 세포를 분무하고 가열된 아르곤 가스와 혼합하여 입자를 포함한 세포를 건조시킨다.시료-가스 혼합물은 아르곤 플라즈마 토치로 초점을 맞추고 점화됩니다.이것은 세포들을 각각의 원자로 쪼개 이온 구름을 만든다.환경공기와 생체분자에서 발생하는 풍부한 저중량 이온을 4극 질량분석기를 이용해 제거한다.항체 태그의 나머지 중이온은 비행 시간 질량 [1]분석법에 의해 정량화된다.이온 함량은 세포당 목표물의 양과 관련이 있으며 세포 [2]품질을 추론하는 데 사용될 수 있습니다.

다른 이온을 검출하는 질량 분석의 민감도는 형광 [3][4]탐침 사용 시 스펙트럼 중첩 문제를 피하면서 세포당 50개 이상의 목표물을 측정할 수 있다.그러나 이 민감도는 미량 중금속 오염이 [5]우려된다는 것을 의미합니다.다수의 프로브를 사용하면 생성된 [6]고차원 데이터를 분석할 때 새로운 문제가 발생합니다.

그림 1: CyTOF 절차의 주요 절차ICP-MS 기계에 대한 동위원소 킬레이트, 항체 태깅, 세포 염색 및 에어로졸 주입 및 데이터 분석.

역사

1994년, 노미즈 쓰토무와 나고야 대학의 동료들은 최초의 단세포 질량 분석 실험을 실시했다.노미즈는 플라즈마에서 단세포를 분무, 건조, 점화해 이온 구름을 만들어 낼 수 있다는 것을 알아냈다.[7]이런 유형의 실험에서는 세포 내 칼슘과 같은 실험 요소를 정량화할 수 있었다.Flow cytometry에서 영감을 받아 2007년 Scott D.태너는 랜턴 금속을 사용하여 DNA 및 세포 표면 [8]마커를 라벨링하는 최초의 다중 분석과 함께 이 ICP-MS를 기반으로 구축되었습니다.2008년 태너는 ICP-MS 기계에 대한 흐름 세포계의 탠덤 부착과 세포 [9]마커의 대규모 다중 분석을 가능하게 하는 새로운 항체 태그에 대해 설명했습니다.플로우 커플링 ICP-MS 머신의 검출 속도와 감도를 한층 더 최적화해, 최초의 CyTOF [1]머신을 구축했습니다.

CyTOF 머신은 원래 캐나다 DVS Sciences사가 소유하고 있었지만 2014년 DVS 사이언스를 인수한 후 현재는 Fluidigm의 독점 제품입니다.CyTOF, CyTOF2 및 Helios™[5]라는 이름의 CyTOF 장치가 세 번 반복되었습니다.Helios 기계는 ytrium-89에서 비스무트-209까지의 금속을 검출하고 분당 2000개의 이벤트를 분석하여 검출 범위와 소프트웨어 파라미터를 크게 향상시켰습니다.

워크플로우

생물학적 샘플의 배경이 매우 [10]낮기 때문에 Lanthanide 그룹의 원소는 항체에 태그를 붙이는 데 사용됩니다.바이오마커에 적합한 동위원소를 선택할 때 저발현 바이오마커는 신호 [11]강도가 높은 동위원소와 쌍으로 해야 한다.순도가 낮은 동위원소를 사용해야 하는 경우 비특이적 결합이나 배경을 최소화하기 위해 낮은 발현 바이오마커와 쌍을 이루어야 한다.

디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA) 킬레이터를 사용하여 이온을 [11]결합시키는 동위원소 폴리머.폴리머는 항체의 [12]Fc 영역에서 환원된 이황화물과 결합하는 티올 또는 말레이미드로 끝납니다.4~5개의 폴리머가 항체에 결합되어 [12]항체당 약 100개의 동위원소 원자가 된다.태그 부착 항체는 용액에 담그거나 비즈와 결합되거나 표면이 고정될 수 있습니다.세포 염색은 플로우 세포 측정의 [12]형광 염색과 동일한 절차를 따릅니다.

살아있는 세포와 죽은 세포를 구별하기 위해, 세포는 죽은 세포에만 침투할 수 있는 인터칼레이터인 로듐으로 조사할 수 있다.그리고 나서 모든 세포는 이리듐으로 염색되고,[12] 이리듐은 모든 세포를 투과하여 살아있는 세포를 시각적으로 이리듐은 모든 세포를 투과합니다.

질량 세포계의 세포 도입 방법은 에어로졸 스플리터 [11]주입이다.그리고 나서 세포는 아르곤 가스의 흐름에서 포착되고, 그 후 플라즈마로 운반되어 기화, 원자화, 이온화된다.그 세포는 이제 이온 구름으로 되어 이온광학 중심부를 통과한다.그런 다음 비행 시간 분석기를 사용하여 이온의 질량을 측정합니다.

데이터 분석

이온은 분광계를 통해 펄스로 가속됩니다.단일 셀에서 발생하는 전자 구름은 일반적으로 10-150 펄스입니다.Helios™ 실행의 출력은 각 질량 채널의 이온에서 측정된 전자 강도를 포함하는 이진 통합 질량 데이터(IMD) 파일입니다.연속 펄스는 하나의 셀에서 생성된 이온 구름에 해당하는 개별 셀 이벤트로 분해되어야 합니다.사용자가 설정한 낮은 회전수 임계값을 통과하는 10~150개의 펄스 중 각 빈은 Helios™ 소프트웨어에 [1][5]의해 셀 이벤트로 간주됩니다.낮은 회전 임계값은 셀 이벤트로 간주되기 위해 모든 이온 채널에 걸쳐 도달해야 하는 최소 이온 카운트입니다.이 파라미터의 값은 측정되는 이온의 수에 따라 증가하므로 라벨이 [5]더 많이 사용될 경우 셀 이벤트를 정의하기 위해 더 많은 카운트가 필요합니다.

데이터 분석을 위해 IMD 파일은 흐름 세포 측정 표준(FCS) 형식으로 변환됩니다.이 파일에는 매트릭스에 배열된 모든 셀에 대한 각 채널의 총 이온 카운트가 포함되어 있으며 흐름 세포 [5]측정 중에 생성된 파일과 동일합니다.이 데이터의 수동 게이트는 플로우 세포 측정과 마찬가지로 수행할 수 있으며 플로우 세포 측정 분석에 사용할 수 있는 대부분의 도구는 CyTOF로 이식되었습니다(플로우 세포 측정 바이오 [6]정보학 참조).CyTOF 데이터는 일반적으로 고차원적입니다.세포 집단 차원성 감소 알고리즘은 세포 집단 간의 관계를 설명하기 위해 자주 사용된다.몇 가지 다차원 분석 클러스터링 알고리즘이 일반적입니다.일반적인 툴로는 tSNE, FlowSOM 및 확산 의사시간(DPT)[6]이 있습니다.하위 분석 방법은 연구 목표에 따라 달라집니다.

적용들

CyTOF는 단백질 발현, 면역표현형, 기능적 특징에 대한 중요한 정보를 단일 세포 수준에서 제공합니다.많은 수의 매개변수가 이 복잡한 [13][11]시스템의 작동을 설명하는 데 도움을 준 면역학에서 중요한 도구입니다.예를 들어, 천연 킬러 세포는 다양한 조합의 수많은 마커에 영향을 받는 다양한 특성을 가지고 있어 이 기술 [14]이전에는 쉽게 분석할 수 없었다.많은 바이오마커를 동시에 측정하면 하나의 복잡한 [13]세포 그룹 내에서 30개 이상의 서로 다른 면역표현형 서브셋을 식별할 수 있다.이것은 면역 기능, 전염병, 암을 보다 완벽하게 특징짓고 치료에 대한 세포의 반응을 이해하는 데 도움을 줄 수 있다.

장점과 단점

CYTOF의 주요 장점은 다른 세포측정법보다 패널당 더 많은 파라미터를 조사할 수 있다는 것입니다.이것에 의해, 복잡하고 겹치는 다수의 패널 없이, 복잡하고 이질적인 셀 집단을 보다 잘 이해할 수 있습니다.패널에는 최대 45개의 항체가 포함될 수 있지만, 이는 플로우 세포 측정에서 수행할 수 있는 10개의 항체와 달리 [13]설계에는 뛰어난 전문 지식이 필요합니다.패널당 더 많은 항체를 사용하면 시간을 절약하고 더 큰 그림을 이해할 수 있으며 실험당 더 적은 수의 세포를 필요로 하므로 종양 [4]연구와 같이 샘플이 제한적일 때 특히 유리하다.

중금속 동위원소를 사용하는 것도 형광 항체를 사용하는 것에 비해 배경을 낮춥니다.골수 세포와 같은 일부 세포 유형은 흐름 [4]세포 측정에서 많은 백그라운드 노이즈를 발생시키는 높은 자기 형광 비율을 가지고 있습니다.그러나 사용되는 희귀 중금속 동위원소는 생물학적 시스템에 존재하지 않기 때문에 배경이 거의 없거나 전혀 보이지 않으며 전반적인 민감도가 증가한다.[4]형광 세포 측정에서 볼 수 있는 중첩에 비해 다른 중금속 간의 검출 중첩도 매우 낮기 때문에 여러 마커로 구성된 패널을 설계하는 것이 훨씬 더 간단하다.

형광 염료는 광 표백되기 때문에 염색 후 몇 시간 이내에 모든 과정이 진행되어야 합니다.그러나 금속 태그 부착 항체는 신호를 잃지 않고 최대 2주 동안 생존할 수 있어 실험에 유연성을 더합니다.착색된 검체는 저온 보존할 수도 있으며,[4] 이는 검체가 장기간 수집될 때 임상시험에 특히 유용할 수 있습니다.

CyTOF는 금속 태그 부착 항체와 항체 결합 키트가 비싸기 때문에 비용이 많이 든다.CyTOF의 주요 단점은 획득 유량이 흐름 세포계에 비해 거의 크기 순서로 [11][4]매우 느리다는 것이다.실험실 시약에는 중금속이 흔하기 때문에 검체 준비 시 오염을 방지하는 것이 매우 중요합니다.

레퍼런스

  1. ^ a b c Bandura DR, Baranov VI, Ornatsky OI, Antonov A, Kinach R, Lou X, et al. (August 2009). "Mass cytometry: technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma time-of-flight mass spectrometry". Analytical Chemistry. 81 (16): 6813–22. doi:10.1021/ac901049w. PMID 19601617.
  2. ^ Wang W, Su B, Pang L, Qiao L, Feng Y, Ouyang Y, et al. (June 2020). "High-dimensional immune profiling by mass cytometry revealed immunosuppression and dysfunction of immunity in COVID-19 patients". Cellular & Molecular Immunology. 17 (6): 650–652. doi:10.1038/s41423-020-0447-2. PMC 7186533. PMID 32346099.
  3. ^ Spitzer MH, Nolan GP (May 2016). "Mass Cytometry: Single Cells, Many Features". Cell. 165 (4): 780–91. doi:10.1016/j.cell.2016.04.019. PMC 4860251. PMID 27153492.
  4. ^ a b c d e f Gadalla R, Noamani B, MacLeod BL, Dickson RJ, Guo M, Xu W, et al. (2019). "Validation of CyTOF Against Flow Cytometry for Immunological Studies and Monitoring of Human Cancer Clinical Trials". Frontiers in Oncology. 9: 415. doi:10.3389/fonc.2019.00415. PMC 6534060. PMID 31165047.
  5. ^ a b c d e Olsen LR, Leipold MD, Pedersen CB, Maecker HT (February 2019). "The anatomy of single cell mass cytometry data". Cytometry. Part A. 95 (2): 156–172. doi:10.1002/cyto.a.23621. PMID 30277658.
  6. ^ a b c Palit S, Heuser C, de Almeida GP, Theis FJ, Zielinski CE (2019). "Meeting the Challenges of High-Dimensional Single-Cell Data Analysis in Immunology". Frontiers in Immunology. 10: 1515. doi:10.3389/fimmu.2019.01515. PMC 6634245. PMID 31354705.
  7. ^ Nomizu T, Kaneco S, Tanaka T, Ito D, Kawaguchi H, Vallee BT (1994-10-01). "Determination of Calcium Content in Individual Biological Cells by Inductively Coupled Plasma Atomic Emission Spectrometry". Analytical Chemistry. 66 (19): 3000–3004. doi:10.1021/ac00091a004.
  8. ^ Tanner SD, Ornatsky O, Bandura DR, Baranov VI (March 2007). "Multiplex bio-assay with inductively coupled plasma mass spectrometry: Towards a massively multivariate single-cell technology". Spectrochimica Acta Part B: Atomic Spectroscopy. 62 (3): 188–195. Bibcode:2007AcSpe..62..188T. doi:10.1016/j.sab.2007.01.008.
  9. ^ Tanner SD, Bandura DR, Ornatsky O, Baranov VI, Nitz M, Winnik MA (2008-01-01). "Flow cytometer with mass spectrometer detection for massively multiplexed single-cell biomarker assay". Pure and Applied Chemistry. 80 (12): 2627–2641. doi:10.1351/pac200880122627. S2CID 53364129.
  10. ^ Ornatsky OI, Kinach R, Bandura DR, Lou X, Tanner SD, Baranov VI, et al. (2008-03-28). "Development of analytical methods for multiplex bio-assay with inductively coupled plasma mass spectrometry". Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 23 (4): 463–469. doi:10.1039/B710510J. PMC 2600572. PMID 19122859.
  11. ^ a b c d e Chattopadhyay PK, Roederer M (July 2012). "Cytometry: today's technology and tomorrow's horizons". Methods. Flow Cytometry and Cell Sorting: the Next Generation. 57 (3): 251–8. doi:10.1016/j.ymeth.2012.02.009. PMC 3374038. PMID 22391486.
  12. ^ a b c d Tanner SD, Baranov VI, Ornatsky OI, Bandura DR, George TC (May 2013). "An introduction to mass cytometry: fundamentals and applications". Cancer Immunology, Immunotherapy. 62 (5): 955–65. doi:10.1007/s00262-013-1416-8. PMID 23564178. S2CID 8607382.
  13. ^ a b c Bjornson ZB, Nolan GP, Fantl WJ (August 2013). "Single-cell mass cytometry for analysis of immune system functional states". Current Opinion in Immunology. Host pathogens / Immune senescence. 25 (4): 484–94. doi:10.1016/j.coi.2013.07.004. PMC 3835664. PMID 23999316.
  14. ^ Leipold MD, Newell EW, Maecker HT (2015). "Multiparameter Phenotyping of Human PBMCs Using Mass Cytometry". In Shaw AC (ed.). Immunosenescence. Methods in Molecular Biology. Vol. 1343. New York, NY: Springer. pp. 81–95. doi:10.1007/978-1-4939-2963-4_7. ISBN 978-1-4939-2963-4. PMC 4748856. PMID 26420710.