Western blot
Western blot, ponekad zvani i kao proteinski imunoblot ili western blotiranje, je široko upotrebljavana analitička tehnika u molekulskoj biologiji i imunogenetici za otkrivanje specifičnih proteina u uzorku homogenata ili ekstrakta tkiva.
Da bi postigla razdvajanje određenog proteina od kompleksa, western blot tehnika koristi tri elementa: razdvajanje po veličini, prijenos proteina na čvrsti nosač i obilježavanje ciljnog proteina pomoću primarnog i sekundarnog antitijela, za vizualizaciju. Stvara se sintetsko ili životinjsko antitijelo (poznato kao primarno antitijelo) koje prepoznaje i veže se za određenu metu proteina. Membrana za elektroforezu se opere u rastvoru koji sadrži primarno antitijelo, prije nego što se ispere višak antitijela. Dodaje se sekundarno antitijelo koje prepoznaje i veže se za primarno antitijelo. Sekundarno antitelo se vizualizira različitim metodima, kao što su bojenje, imunofluorescencija i radioaktivnost, omogućavajući indirektno otkrivanje specifičnog ciljnog proteina.
Ostale srodne tehnike uključuju dot blot analizu, kvantitativni tačkasti blot, imunohistohemijske i imunocitohemijske postupke, gdje se antitijela koriste za otkrivanje proteina u tkivima i ćelijama i enzimski imunski test (ELISA).
Naziv 'western blot' igra je na u poređenju sa Southern blot, tehnikom za otkrivanje DNK koja je nazvana po svom pronalazaču, engleskom biologu Edwinu Southernu. Slično tome, otkrivanje RNK naziva se Northern blot.[2] Termin "vestern blot" dao je W. Neal Burnette 1981. godine,[3] iako je sam metod nastao 1979. u laboratoriji Harryja Towbina na Institutu Friedrich Miescher u Baselu, Švicarska.[4] Između 1979. i 2019, spomenut je u naslovima, sažecima i ključnim riječima u više od 400 000 PubMed popisanih publikacija i još uvijek može biti najčešće korištena proteinsko-analitička tehnika.[5]
Primjena
[uredi | uredi izvor]Western blot se opsežno koristi u biohemiji za kvalitativno otkrivanje pojedinačnih proteina i njihovih modifikacija (kao što su posttranslacijske modifikacije). Procjenjuje se da najmanje 8-9% svih publikacija povezanih s proteinima primjenjuje Western blot.[5] Koristi se kao opći metod za identificiranje prisustva specifičnog pojedinačnog proteina u složenoj mješavini proteina. Polukvantitativna procjena proteina može se izvesti iz veličine i intenziteta boje proteinske trake na blot membrani. Pored toga, primjena serija razrjeđenja pročišćenog proteina poznatih koncentracija, može se koristiti da bi se omogućila preciznija procjena koncentracije proteina. Western blot se rutinski koristi za verifikaciju proizvodnje proteina nakon kloniranja. Također se koristi u medicinskoj dijagnostici, npr. u HIV-testu ili BSE.
Potvrđujući HIV test koristi Western blot za otkrivanje antitijela na HIV u uzorku seruma. Proteini iz poznatih HIV-zaraženih ćelija odvajaju se i upijaju na membranu kao što je gore opisano. Zatim se serum koji se testira nanosi u koraku primarne inkubacije antitijela; slobodno antitijelo se ispere, a doda se sekundarno anti-ljudsko antitijelo povezano sa enzimskim signalom. Obojene trake tada ukazuju na proteine na koje pacijentov serum sadrži antitijela.[6]
Western blot se takođe koristi kao konačni test za varijantnu Creutzfeldt-Jakobove bolesti, tipa prionske bolesti povezane sa konzumacijom kontaminirane govedine od goveda sa goveđom spongiformnom encefalopatijom (BSE, obično se naziva i 'bolest ludih krava').[7]
Ostala područja primjene su u dijagnozi tularemije. Procjena sposobnosti Western blot-a da detektira antitijela protiv F. tularensis otkrila je da je njegova osjetljivost gotovo 100%, a specifičnost 99,6%.[8]
Neki oblici testiranja na lajmsku bolest koriste Western bloting.[9] A western blot can also be used as a confirmatory test for Hepatitis B infection and HSV-2 (Herpes Type 2) infection.[10][11] U veterinarskoj medicini se Western blot ponekad koristi za potvrđivanje FIV + statusa kod mačaka.[12]
Daljnja primjena Western blot tehnike uključuju upotrebu Svjetske antidoping agencije (WADA). Doping krvi je zloupotreba određenih tehnika i / ili supstanci za povećanje nečije mase crvenih krvnih zrnaca, što omogućava tijelu da transportuje više kisika u mišiće i time povećava izdržljivost i performanse. Postoje tri široko poznate supstance ili metode koje se koriste za doping krvi, a to su eritropoetin (EPO), sintetski nosači kisika i transfuzija krvi. Svaka je zabranjena WADA-inom listom zabranjenih supstanci i metoda. Western blot tehnika korištena je tokom FIFA-inog svjetskog kupa 2014. u antidoping kampanji za taj događaj.[13] Ukupno je preko Reichela i saradnika [14] sakupljeno i analizirano preko 1.000 uzoraka u WADA akreditovanoj laboratoriji u Lozani, Švicarska. Nedavna istraživanja koja koriste Western blot tehniku pokazala su poboljšanu detekciju EPO u krvi i urinu na osnovu novih Velum SAR sklopnih horizontalnih gelova, optimizovanih za rutinsku analizu.[15] Usvajanjem horizontalne SAR-PAGE u kombinaciji sa Velum SAR gelovima koji su podržani od gotovog filma, diskriminacijski kapacitet primjene mikro-doze rEPO je značajno pojačan.
Također pogledajte
[uredi | uredi izvor]References
[uredi | uredi izvor]- ^ Yang, Ping-Chang; Mahmood, Tahrin (2012). "Western blot: Technique, theory, and trouble shooting". North American Journal of Medical Sciences. 4 (9): 429. doi:10.4103/1947-2714.100998. ISSN 1947-2714. PMC 3456489.
- ^ Alwine J, Kemp D, Stark G (1977). "Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes". Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 74 (12): 5350–5354. Bibcode:1977PNAS...74.5350A. doi:10.1073/pnas.74.12.5350. PMC 431715. PMID 414220.
- ^ Burnette WN. (1981). "'Western blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate—polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A". Analytical Biochemistry. 112 (2): 195–203. doi:10.1016/0003-2697(81)90281-5. ISSN 0003-2697. PMID 6266278.
- ^ Towbin H, Staehelin T, Gordon J (1979). "Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications". Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (9): 4350–54. Bibcode:1979PNAS...76.4350T. doi:10.1073/pnas.76.9.4350. PMC 411572. PMID 388439.
- ^ a b Moritz CP (2020). "40 years Western blotting: A scientific birthday toast". Journal of Proteomics. 212: 103575. doi:10.1016/j.jprot.2019.103575. PMID 31706026.
- ^ Sudha, T; Lakshmi, S; Teja, VD (2006). "Western blot profile in HIV infection". Indian Journal of Dermatology, Venereology and Leprology. 72 (5). doi:10.4103/0378-6323.27752. PMID 17050930. Pristupljeno 6. 12. 2020.
- ^ Ingrosso, Loredana; Vetrugno, Vito; Cardone, Franco; Pocchiari, Maurizio (1. 6. 2002). "Molecular diagnostics of transmissible spongiform encephalopathies". Trends in Molecular Medicine. 8 (6): 273–280. doi:10.1016/S1471-4914(02)02358-4. PMID 12067613.
- ^ SCHMITT, P.; SPLETTSTÖSSER, W.; PORSCH-ÖZCÜRÜMEZ, M.; FINKE, E.-J.; GRUNOW, R. (16. 2. 2005). "A novel screening ELISA and a confirmatory Western blot useful for diagnosis and epidemiological studies of tularemia". Epidemiology and Infection. 133 (4): 759–766. doi:10.1017/s0950268805003742. ISSN 0950-2688. PMC 2870305. PMID 16050523.
- ^ Artsob, Harvey (1993). "Western Blot as a confirmatory test for Lyme disease". The Canadian Journal of Infectious Diseases. 4 (2): 115–116. doi:10.1155/1993/796390. PMC 3250769. PMID 22346434.
- ^ Castro, L De; Yoshida, C F; Gasper, A M; Gomes, S A (decembar 1996). "Western blot analysis of the reactivity between envelope proteins of hepatitis B viruses from Brazilian carriers and antibodies raised against recombinant hepatitis B vaccines". Acta Virol. 40 (5–6). PMID 9171452. Pristupljeno 6. 12. 2020.
- ^ Golden, Matthew; Ashley-Morrow, Rhoda; Swenson, Paul; Hogrefe, Wayne R; Handsfield, H Hunter; Wald, Anna (decembar 2005). "Herpes simplex virus type 2 (HSV-2) Western blot confirmatory testing among men testing positive for HSV-2 using the focus enzyme-linked immunosorbent assay in a sexually transmitted disease clinic". Sexually Transmitted Disease. 32 (12). doi:10.1097/01.olq.0000175377.88358.f3. Pristupljeno 6. 12. 2020.
- ^ "FIV testing – which to use". Catwork. Pristupljeno 6. 12. 2020.
- ^ Baume, Norbert; Jan, Nicolas; Emery, Caroline; Mandanis, Béatrice; Schweizer, Carine; Giraud, Sylvain; Leuenberger, Nicolas; Marclay, François; Nicoli, Raul; Perrenoud, Laurent; Robinson, Neil; Dvorak, Jiri; Saugy, Martial (2015). "Antidoping programme and biological monitoring before and during the 2014 FIFA World Cup Brazil". British Journal of Sports Medicine. 49 (9): 614–622. doi:10.1136/bjsports-2015-094762. ISSN 0306-3674. PMC 4413745. PMID 25878079.
- ^ Reichel C, Benetka W, Lorenc B, Thevis M (2016). "Evaluation of AMGEN clone 9G8A anti-Epo antibody for application in doping control". Drug Test Anal. 8 (11–12): 1131–1137. doi:10.1002/dta.2057. PMID 27552163.
- ^ https://precisionbiosystems.com/wp-content/uploads/2016/10/Application_Note_Improvements-for-EPO-detection_Schwenke_2015.pdf
Vanjski linkovi
[uredi | uredi izvor]| Bibliotečki resursi about Western immunoblotting |
- Yang, Ping-Chang; Mahmood, Tahrin (2012). "Western blot: Technique, theory, and trouble shooting". North American Journal of Medical Sciences. 4 (9): 429. doi:10.4103/1947-2714.100998. ISSN 1947-2714. PMC 3456489. PMID 23050259.
- "Western Blotting". YouTube. Bio-Rad Laboratories. 16. 10. 2012.
- "Blotting Techniques/ The Principle of Western Blotting". YouTube. Biomedical and Biological Sciences. 23. 3. 2017.