WO2024111657A1

WO2024111657A1 - タンパク質の製造方法

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Publication number: WO2024111657A1
Application number: PCT/JP2023/042131
Authority: WO
Inventors: カテリナファルクシナ; 来時河出; 祥平小林; 純一中山; 孝裕野中
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2022-11-25
Filing date: 2023-11-24
Publication date: 2024-05-30
Anticipated expiration: 2025-05-25
Also published as: TW202436348A; EP4624489A1; CN120265651A; WO2025109783A1; AU2023387113A1; IL320881A; MX2025005439A; AR131163A1; JPWO2024111657A1; KR20250111141A

Abstract

一態様において、クロマトグラフィー内で、ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間で形成される少なくとも１つのジスルフィド結合を有する抗原結合分子と当該抗原結合分子のジスルフィド結合のミスマッチ体および／または形成不全体を含む混合物と還元剤を含む溶液とを接触させ、その後還元剤を除去することにより、より効率よく、かつ再現性高く、ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間で形成される少なくとも１つのジスルフィド結合を有する抗原結合分子を含む調製物を製造することが可能であることが見出された。

Description

タンパク質の製造方法

　本開示は、ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間に形成される少なくとも1つのジスルフィド結合を有する抗原結合分子の製造方法に関する。また本開示は、そのような抗原結合分子を増加させるまたは濃縮するための方法、および抗原結合分子のジスルフィド結合の不均一性を除去するための方法等に関する。

　ヒンジ領域外の領域におけるアミノ酸残基間に人工的なジスルフィド結合（「LINC」）を有する抗原結合分子（LINC-Ig）が知られている（特許文献1～4）。LINC-Igは、例えば、抗原結合分子を構成する2つの抗体重鎖の一方のCH1領域と他方のCH1領域との間にジスルフィド結合を有する。しかしながら、このような抗原結合分子を取得するために当該分子を細胞培養液中で発現させた場合、細胞培養液中において、重鎖間に適切なジスルフィド結合を有する分子（LINCフォーマット）と当該分子のミスマッチ体や形成不全体などの適切なジスルフィド結合を有さない分子（unLINCフォーマット）の二種類の形態が混在する。LINC-Igの調製においては、細胞培養液に含まれる、硫黄原子がキャップ化されたオープン型分子など重鎖間に適切なジスルフィド結合が形成されていない分子を、適切なジスルフィド結合を有する分子に変換する必要がある。

　ヒンジ領域以外の領域のアミノ酸残基を介して、重鎖間に適切なジスルフィド結合が形成されたLINC-Igを取得する方法として、以下が知られている。
　特許文献2、4には、重鎖間にジスルフィド結合を有する分子とジスルフィド結合が適切に形成されていない分子を含む調製物を還元剤で処理し、その後、バッファー交換などによる再酸化を行うことでジスルフィド結合を形成させ、LINCを有する抗体を効率よく取得する方法が開示されている。

　特許文献5には、抗体の断片化を防ぐ目的で還元-酸化反応をDown Stream Processにて行うことができるようレドックス緩衝液（例：Cysteine/Cystine）を利用することが開示されている。

　特許文献6には、酸化還元カップリング試薬との接触により組み換え抗体をリフォールディングする方法について開示されている。

　非特許文献1には、レドックス緩衝液を用いて、特定の抗体（MAB007）においてCysteinylationによるロット間の不均一性を抑制したことが開示されている。

WO2020/027330 WO2021/157679 WO2021/200898 WO2021/201087 WO2020/037016 WO2006/047340

Pharm Sci. 2008 Feb;97(2):775-90, Removal of Cysteinylation from an Unpaired Sulfhydryl in the Variable Region of a Recombinant Monoclonal IgG1 Antibody Improves Homogeneity, Stability, and Biological Activity

　上述の通り、重鎖間に適切なジスルフィド結合を有する抗原結合分子とジスルフィド結合が適切に形成されていない抗原結合分子（例えば、キャッピング分子など）を含む混合物を還元剤で処理し、その後、再酸化を行うことで、LINCを有する抗原結合分子を効率よく取得する方法が知られている。しかしながら、この方法には、収率が低い、反応時間が長いといった生産性や製造容易性の観点から課題があった。

　本開示は、上述の課題を解決するために、抗体重鎖間に適切なジスルフィド結合を有する抗原結合分子の効率的かつ容易な製造および精製方法を提供することを目的とする。本開示は、2つの抗体重鎖のそれぞれのヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間で形成される1つまたは複数のジスルフィド結合を有する抗原結合分子の構造均一性および相対的存在量を増加させるための方法に関する。換言すると、本開示は、ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間に適切なジスルフィド結合を有さない抗原結合分子の相対的存在量を減少させるための方法に関する。

　本発明者らは、上記課題を解決すべく検討を行った。その結果本発明者らは、アフィニティカラムに結合した、ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間に少なくとも１つのジスルフィド結合を形成しうるアミノ酸残基を有する抗原結合分子（これらの抗原結合分子は、ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間にジスルフィド結合が適切に形成されている抗原結合分子、および、ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間に少なくとも１つのジスルフィド結合が適切に形成されていない抗原結合分子を含む）に還元剤を接触させ、その後還元剤を除去することにより、より効率よく、かつ再現性高く、ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間において少なくとも１つのジスルフィド結合を形成させることが可能であることを見出した。具体的には、本発明者らは、細胞培養液(Harvested cell culture fluid: HCCF)からの一次精製として汎用的に用いられる手法であるProtein Aアフィニティクロマトグラフィーによる精製工程の中に、還元剤を含む溶液の通液、ならびに、還元剤の除去の2つの工程を挿入することで、高収率かつ安定的に、ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間に少なくとも１つのジスルフィド結合を有する抗原結合分子（LINC-Igフォーマット）を得る手法を開発した。

　本開示はこのような知見に基づくものであり、具体的には以下に関する。
〔１〕ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間で形成される少なくとも１つのジスルフィド結合を有する抗原結合分子を含む調製物の製造方法であって、還元剤存在下でヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間に少なくとも１つのジスルフィド結合を形成しうるアミノ酸残基を有する抗原結合分子をクロマトグラフィーに供する工程を含む、方法。
〔２〕ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間で形成される少なくとも１つのジスルフィド結合を有する抗原結合分子を含む調製物の製造方法であって、以下の工程を含む、方法；
（ａ）クロマトグラフィー内で、ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間に少なくとも１つのジスルフィド結合を形成しうるアミノ酸残基を有する抗原結合分子と、還元剤を含む溶液とを接触させる工程、および
（ｂ）還元剤を除去する工程。
〔３〕ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間で形成される少なくとも１つのジスルフィド結合を有する抗原結合分子を含む調製物の製造方法であって、還元剤存在下で、ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間で形成される少なくとも１つのジスルフィド結合を有する抗原結合分子と当該抗原結合分子のジスルフィド結合のミスマッチ体および／または形成不全体を含む混合物をクロマトグラフィーに供する工程を含む、方法。
〔４〕ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間で形成される少なくとも１つのジスルフィド結合を有する抗原結合分子を含む調製物の製造方法であって、以下の工程を含む、方法：
（ａ）クロマトグラフィー内で、ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間で形成される少なくとも１つのジスルフィド結合を有する抗原結合分子と当該抗原結合分子のジスルフィド結合のミスマッチ体および／または形成不全体を含む混合物と、還元剤を含む溶液とを接触させる工程、および
（ｂ）還元剤を除去する工程。
〔５〕抗原結合分子が２以上のポリペプチド鎖を含み、前記ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間で形成される少なくとも1つのジスルフィド結合がポリペプチド鎖間で形成されていることを特徴とする、〔１〕～〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕前記ポリペプチド鎖の片方もしくは双方が、ヒンジ領域以外の領域において、変異、置換、または導入されたシステイン残基を有する、〔５〕に記載の方法。
〔７〕抗原結合分子が第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインを含み、前記ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間で形成される少なくとも１つのジスルフィド結合が第一の抗原結合ドメインと第二の抗原結合ドメインとの間で形成されている、〔１〕～〔６〕のいずれかに記載の方法。
〔８〕抗原結合分子が第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインを含み、前記ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間で形成される少なくとも１つのジスルフィド結合が第一の抗原結合ドメインの重鎖と第二の抗原結合ドメインの重鎖との間で形成されている、〔１〕～〔７〕のいずれかに記載の方法。
〔９〕抗原結合分子が第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインを含み、前記ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間で形成される少なくとも１つのジスルフィド結合が第一の抗原結合ドメインのCH1領域と第二の抗原結合ドメインのCH1領域との間で形成されている、〔１〕～〔８〕のいずれかに記載の方法。
〔１０〕抗原結合分子が第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインを含み、前記ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間で形成される少なくとも１つのジスルフィド結合が第一の抗原結合ドメインの重鎖のEUナンバリング191位のアミノ酸残基と第二の抗原結合ドメインの重鎖のEUナンバリング191位のアミノ酸残基との間で形成されている、〔１〕～〔９〕のいずれかに記載の方法。
〔１１〕前記クロマトグラフィーが、アフィニティクロマトグラフィー担体、イオン交換クロマトグラフィー担体、疎水性相互作用クロマトグラフィー担体、イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーの両方を含むマルチモードクロマトグラフィー担体、またはハイドロキシアパタイト担体を含む、〔１〕～〔１０〕のいずれかに記載の方法。
〔１２〕アフィニティクロマトグラフィー担体が、プロテインＡ担体、プロテインＧ担体、プロテインＬ担体、配列選択的なペプチド担体、および抗原結合分子に選択的に結合する担体からなる群より選択される、〔１１〕に記載の方法。
〔１３〕イオン交換クロマトグラフィー担体が、陽イオン交換リガンド、または陰イオン交換リガンドである、〔１１〕に記載の方法。
〔１４〕疎水性相互作用クロマトグラフィー担体が、疎水性リガンドである、〔１１〕に記載の方法。
〔１５〕マルチモードクロマトグラフィー担体が、陽イオン交換リガンドと疎水性リガンドを組み合わせた担体、または陰イオン交換リガンドと疎水性リガンドを組み合わせた担体である、〔１１〕に記載の方法。
〔１６〕ハイドロキシアパタイト担体が、ハイドロキシアパタイトまたはその転換体（フルオロアパタイトなど）である、〔１１〕に記載の方法。
〔１７〕カラムクロマトグラフィーのカラム内に充填または膜クロマトグラフィーの膜上に塗布されたクロマトグラフィー担体と、ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間で形成される少なくとも１つのジスルフィド結合を有する抗原結合分子と当該抗原結合分子のジスルフィド結合のミスマッチ体および／または形成不全体を含む混合物とを接触させる工程を含む、〔１〕から〔１６〕のいずれか１つに記載の方法。
〔１８〕還元剤がモノチオール、ジチオール、ホスフィン、および無機試薬、ならびにこれらの２以上の組み合わせからなる群より選択される、〔１〕から〔１７〕のいずれか１つに記載の方法。
〔１９〕還元剤がシステインまたはＴＣＥＰである、〔１〕から〔１８〕のいずれか１つに記載の方法。
〔２０〕還元剤がモノチオールであり、還元剤の濃度が約０.０１ｍＭ～約１００ｍＭである、〔１〕から〔１８〕のいずれか１つに記載の方法。
〔２１〕還元剤がシステインであり、還元剤の濃度が約０.０１ｍＭ～約１００ｍＭ、約０．０００１ｍＭ～約１００．０ｍＭ、約０．００１ｍＭ～約１００．０ｍＭ、約０．００５ｍＭ～約７５．０ｍＭ、約０．０１ｍＭ～約５０．０ｍＭ、約０．０５ｍＭ～約２５．０ｍＭ、または約０．１ｍＭ～約１０ｍＭである、〔１〕から〔１９〕のいずれか１つに記載の方法。
〔２２〕還元剤がジチオールであり、還元剤の濃度が約０.００１ｍＭ～約１０ｍＭである、〔１〕から〔１８〕のいずれか１つに記載の方法。
〔２３〕還元剤がホスフィンであり、還元剤の濃度が約０．０００１ｍＭ～約１ｍＭまたは約０．００１ｍＭ～約０．０１ｍＭである、〔１〕から〔１８〕のいずれか１つに記載の方法。
〔２４〕還元剤がＴＣＥＰであり、還元剤の濃度が約０．００００１ｍＭ～約１０．０ｍＭ、約０．００００５ｍＭ～約５．０ｍＭ、約０．０００１ｍＭ～約１ｍＭ、約０．０００５ｍＭ～約０．５ｍＭ、約０．００１ｍＭ～約０．１ｍＭ、または約０．００１ｍＭ～約０．０１ｍＭである、〔１〕から〔１９〕のいずれか１つに記載の方法。
〔２５〕還元剤が無機試薬であり、還元剤の濃度が約０．０００１ｍＭ～約１０ｍＭまたは約０．００１ｍＭ～約０．１ｍＭである、〔１〕から〔１８〕のいずれか１つに記載の方法。
〔２６〕還元剤がシステインであり、還元剤の濃度が、約０．１ｍＭ、約０．１５ｍＭ、約１．０ｍＭ、約１０．０ｍＭ、または約１００ｍＭである、〔１〕から〔１９〕のいずれか１つに記載の方法。
〔２７〕還元剤がＴＣＥＰであり、還元剤の濃度が、約０．００１ｍＭ、約０．０１ｍＭ、約０．１ｍＭ、または約１．０ｍＭである、〔１〕から〔１９〕のいずれか１つに記載の方法。
〔２８〕還元剤を含む溶液のｐＨが、約４．５～約１０．０、約５．０～約９．０、約６．５～約８．５、または約７．０～約８．０である、〔２〕、および〔４〕から〔２７〕のいずれか１つに記載の方法。
〔２９〕還元剤を含む溶液のｐＨが約７．０、約７．５、または約８．０である、〔２〕、および〔４〕から〔２８〕のいずれか１つに記載の方法。
〔３０〕クロマトグラフィーがカラムクロマトグラフィーまたは膜クロマトグラフィーである、〔１〕から〔２９〕のいずれか１つに記載の方法。
〔３１〕還元剤を含む溶液が、約２秒～約８０分もしくは約３秒～約２４分の通過時間でカラムクロマトグラフィーのカラム内もしくは膜クロマトグラフィーのデバイス内を通液される、または、カラム内もしくはデバイス内に還元剤が充填された状態で一時的に通液が停止される、〔３０〕に記載の方法。
〔３２〕還元剤を含む溶液が、約１２分または約３０秒の通過時間でカラムクロマトグラフィーのカラム内もしくは膜クロマトグラフィーのデバイス内を通液される、または、カラム内もしくはデバイス内に還元剤を含む溶液が充填された状態で一時的に通液が停止される、〔３０〕または〔３１〕に記載の方法。
〔３３〕前記混合物と還元剤を含む溶液とが、約６秒～約１４４０分、または約１８秒～約３００分接触される、〔２〕、および〔４〕から〔３２〕のいずれか１つに記載の方法。
〔３４〕前記混合物と還元剤を含む溶液とが、約１２０分または約７．５分接触される、〔２〕、および〔４〕から〔３３〕のいずれか１つに記載の方法。
〔３５〕還元剤の除去が、抗原結合分子と還元剤を含まない溶液とを接触させることを含む、〔１〕から〔３４〕のいずれか１つに記載の方法。
〔３６〕クロマトグラフィーがカラムクロマトグラフィーまたは膜クロマトグラフィーであり、前記混合物と還元剤を含まない溶液とを接触させることが、還元剤を含まない溶液をカラムクロマトグラフィーのカラム内または膜クロマトグラフィーのデバイス内に通液させることを含む、〔３５〕に記載の方法。
〔３７〕還元剤を含まない溶液が、約２秒～約８０分もしくは約３秒～約２４分の通過時間でカラムクロマトグラフィーのカラム内もしくは膜クロマトグラフィーのデバイス内を通液される、および任意で、カラム内もしくはデバイス内に該溶液が充填された状態で一時的に通液が停止される、〔３５〕または〔３６〕に記載の方法。
〔３８〕還元剤を含まない溶液が、約４分または約３０秒の通過時間でカラムクロマトグラフィーのカラム内もしくは膜クロマトグラフィーのデバイス内を通液される、および任意で、カラム内もしくはデバイス内に該溶液が充填された状態で一時的に通液が停止される、〔３５〕～〔３７〕のいずれかに記載の方法。
〔３９〕前記混合物と還元剤を含まない溶液とが、約６秒～約１４４０分、または約１８秒～約３００分接触される、〔３５〕から〔３８〕のいずれか１つに記載の方法。
〔４０〕前記混合物と還元剤を含まない溶液とが、約２０分または約７．５分接触される、〔３５〕から〔３９〕のいずれか１つに記載の方法。
〔４１〕前記混合物と還元剤を含む溶液とが、約４℃～約３７℃、好ましくは約１５℃～約３７℃で接触される、〔１〕から〔４０〕のいずれか１つに記載の方法。
〔４２〕工程（ａ）の前に、ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間で形成される少なくとも１つのジスルフィド結合を有する抗原結合分子と当該抗原結合分子のジスルフィド結合のミスマッチ体および／または形成不全体を含む混合物とクロマトグラフィーの担体とを接触させ、抗原結合分子をカラムクロマトグラフィーのカラム内に充填させるまたは膜クロマトグラフィーの膜上に固定させる工程をさらに含む、〔１〕から〔４１〕のいずれか１つに記載の方法。
〔４３〕工程（ａ）の前に、クロマトグラフィー内の不純物を除去する工程をさらに含む、〔１〕から〔４２〕のいずれか１つに記載の方法。
〔４４〕工程（ｂ）の前または後に、ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間で形成される少なくとも１つのジスルフィド結合を有する抗原結合分子を回収する工程をさらに含む、〔１〕から〔４３〕のいずれか１つに記載の方法。
〔４５〕抗原結合分子と還元剤を含む溶液との接触により、ジスルフィド結合を形成しうるアミノ酸残基間で形成されていたジスルフィド結合が切断される、および／または、ジスルフィド結合を形成しうるアミノ酸残基における硫黄原子が脱キャップされる、〔１〕から〔４４〕のいずれか１つに記載の方法。
〔４６〕還元剤の除去により、ジスルフィド結合を形成しうるアミノ酸残基間でジスルフィド結合が形成される、〔２〕、および〔４〕から〔４５〕のいずれか１つに記載の方法。
〔４７〕ジスルフィド結合を形成しうるアミノ酸残基が、導入されたまたは操作されたシステイン残基である、〔１〕から〔４６〕のいずれか１つに記載の方法。
〔４８〕ヒンジ領域以外の領域における少なくとも１つのジスルフィド結合が鎖間ジスルフィド結合である、〔１〕から〔４７〕のいずれか１つに記載の方法。
〔４９〕ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間で形成される少なくとも１つのジスルフィド結合が、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の鎖間ジスルフィド結合である、〔１〕から〔４８〕のいずれか１つに記載の方法。
〔５０〕ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間で形成される少なくとも１つのジスルフィド結合が、野生型ＩｇＧには存在しない操作されたジスルフィド結合である、〔１〕から〔４９〕のいずれか１つに記載の方法。
〔５１〕(i) ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間で形成される少なくとも１つのジスルフィド結合を有する抗原結合分子（ＬＩＮＣ体）、および(ii) 当該抗原結合分子のジスルフィド結合のミスマッチ体および／または形成不全体（ｕｎＬＩＮＣ体）の合計に対する、ヒンジ領域以外の領域に少なくとも１つのジスルフィド結合を有する抗原結合分子（ＬＩＮＣ体）の割合（ＬＩＮＣ率）を増加させるための、〔１〕から〔５０〕のいずれか１つに記載の方法。
〔５２〕(i) ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間で形成される少なくとも１つのジスルフィド結合を有する抗原結合分子（ＬＩＮＣ体）、および(ii) 当該抗原結合分子のジスルフィド結合のミスマッチ体および／または形成不全体（ｕｎＬＩＮＣ体）の合計に対して、モル比で、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の、ヒンジ領域以外の領域に少なくとも１つのジスルフィド結合を有する抗原結合分子（ＬＩＮＣ体）を製造するための、〔１〕から〔５１〕のいずれか１つに記載の方法。

　また本開示は、以下の発明に関する。
〔Ａ１〕クロマトグラフィーがカラムクロマトグラフィーである、〔１〕から〔５２〕のいずれか１つに記載の方法。
〔Ａ２〕カラム内に充填されたクロマトグラフィー担体と、ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間で形成される少なくとも１つのジスルフィド結合を有する抗原結合分子と当該抗原結合分子のジスルフィド結合のミスマッチ体および／または形成不全体を含む混合物とを接触させる工程を含む、〔Ａ１〕に記載の方法。
〔Ａ３〕還元剤を含む溶液が、約２分～約８０分の通過時間でカラム内を通液される、および任意で、カラム内に還元剤を含む溶液が充填された状態で一時的に通液が停止される、〔Ａ１〕または〔Ａ２〕に記載の方法。
〔Ａ４〕還元剤を含む溶液が、約４分～約２４分の通過時間でカラム内を通液される、および任意で、カラム内に還元剤を含む溶液が充填された状態で一時的に通液が停止される、〔Ａ１〕から〔Ａ３〕のいずれか１つに記載の方法。
〔Ａ５〕還元剤を含む溶液が、約１２分の通過時間でカラム内を通液される、および任意で、カラム内に還元剤を含む溶液が充填された状態で一時的に通液が停止される、〔Ａ１〕から〔Ａ４〕のいずれか１つに記載の方法。
〔Ａ６〕還元剤を含む溶液が、約２５ｃｍ／時間～約５００ｃｍ／時間、もしくは約５０ｃｍ／時間～約４００ｃｍ／時間の速度でカラムクロマトグラフィーのカラム内を通液される、および任意で、カラム内に還元剤を含む溶液が充填された状態で一時的に通液が停止される、〔Ａ１〕から〔Ａ５〕のいずれか１つに記載の方法。
〔Ａ７〕還元剤を含む溶液が、約１００ｃｍ／時間の速度でカラムクロマトグラフィーのカラム内を通液される、および任意で、カラム内に還元剤を含む溶液が充填された状態で一時的に通液が停止される、〔Ａ１〕から〔Ａ６〕のいずれか１つに記載の方法。
〔Ａ８〕還元剤を含む溶液の通液量が、カラム体積の約０．１倍（約０．１ＣＶ（ｃｏｌｕｍｎ　ｖｏｌｕｍｅ））～約１００倍（約１００ＣＶ）である、〔Ａ１〕から〔Ａ７〕のいずれか１つに記載の方法。
〔Ａ９〕還元剤を含む溶液の通液量が、カラム体積の約１倍（１ＣＶ）～約２０倍（約２０ＣＶ）である、〔Ａ１〕から〔Ａ８〕のいずれか１つに記載の方法。
〔Ａ１０〕還元剤を含む溶液の通液量が、カラム体積の約１０．０倍（約１０．０ＣＶ）である、〔Ａ１〕から〔Ａ９〕のいずれか１つに記載の方法。
〔Ａ１１〕前記混合物と還元剤を含む溶液とが、約４分～約１４４０分接触される、〔Ａ１〕から〔Ａ１０〕のいずれか１つに記載の方法。
〔Ａ１２〕前記混合物と還元剤を含む溶液とが、約８分～約３００分接触される、〔Ａ１〕から〔Ａ１１〕のいずれか１つに記載の方法。
〔Ａ１３〕前記混合物と還元剤を含む溶液とが、約１２０分接触される、〔Ａ１〕から〔Ａ１２〕のいずれか１つに記載の方法。
〔Ａ１４〕担体に担持された抗原結合分子の量が、担体１Ｌあたり、約５ｇ～約８０ｇ、約７ｇ～約５０ｇ、または約１０ｇ～約４０ｇである、〔Ａ１〕から〔Ａ１３〕のいずれか１つに記載の方法。
〔Ａ１５〕還元剤を含まない溶液が、約２分～約８０分の通過時間でカラム内を通液される、または、カラム内に該溶液が充填された状態で一時的に通液が停止される、〔Ａ１〕から〔Ａ１４〕のいずれか１つに記載の方法。
〔Ａ１６〕還元剤を含まない溶液が、約４分～約２４分の通過時間でカラム内を通液される、または、カラム内に該溶液が充填された状態で一時的に通液が停止される、〔Ａ１〕から〔Ａ１５〕のいずれか１つに記載の方法。
〔Ａ１７〕還元剤を含まない溶液が、約４分の通過時間でカラム内を通液される、または、カラム内に該溶液が充填された状態で一時的に通液が停止される、〔Ａ１〕から〔Ａ１６〕のいずれか１つに記載の方法。
〔Ａ１８〕還元剤を含まない溶液が、約２５ｃｍ／時間～約５００ｃｍ／時間、もしくは約５０ｃｍ／時間～約４００ｃｍ／時間の速度でカラムクロマトグラフィーのカラム内を通液される、または、カラム内に該溶液が充填された状態で一時的に通液が停止される、〔Ａ１〕から〔Ａ１７〕のいずれか１つに記載の方法。
〔Ａ１９〕還元剤を含まない溶液が、約３００ｃｍ／時間の速度でカラムクロマトグラフィーのカラム内を通液される、または、カラム内に該溶液が充填された状態で一時的に通液が停止される、〔Ａ１〕から〔Ａ１８〕のいずれか１つに記載の方法。
〔Ａ２０〕還元剤を含まない溶液の通液量が、カラム体積の約０．１倍（約０．１ＣＶ）～約１００倍（約１００ＣＶ）、または約１倍（約１ＣＶ）～約２０倍（約２０ＣＶ）である、〔Ａ１〕から〔Ａ１９〕のいずれか１つに記載の方法。
〔Ａ２１〕還元剤を含まない溶液の通液量が、カラム体積の約５．０倍（約５．０ＣＶ）である、〔Ａ１〕から〔Ａ２０〕のいずれか１つに記載の方法。
〔Ａ２２〕前記混合物と還元剤を含まない溶液とが、約４分～約１４４０分接触される、〔Ａ１〕から〔Ａ２１〕のいずれか１つに記載の方法。
〔Ａ２３〕前記混合物と還元剤を含まない溶液とが、約８分～約３００分接触される、〔Ａ１〕から〔Ａ２２〕のいずれか１つに記載の方法。
〔Ａ２４〕前記混合物と還元剤を含まない溶液とが、約２０分接触される、〔Ａ１〕から〔Ａ２３〕のいずれか１つに記載の方法。

　また本開示は、以下の発明に関する。
〔Ｂ１〕クロマトグラフィーが膜クロマトグラフィーである、〔１〕から〔５２〕のいずれか１つに記載の方法。
〔Ｂ２〕膜クロマトグラフィーの膜上に塗布もしくは固定されたクロマトグラフィー担体と、ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間で形成される少なくとも１つのジスルフィド結合を有する抗原結合分子と当該抗原結合分子のジスルフィド結合のミスマッチ体および／または形成不全体を含む混合物とを接触させる工程を含む、〔Ｂ１〕に記載の方法。
〔Ｂ３〕還元剤を含む溶液が、約２秒～約６０分の通過時間で膜デバイスを通液される、または、膜デバイス内に還元剤を含む溶液が充填された状態で一時的に通液が停止される、〔Ｂ１〕または〔Ｂ２〕に記載の方法。
〔Ｂ４〕還元剤を含む溶液が、約３秒～約６分、例えば約３０秒の通過時間で膜デバイスを通液される、または、膜デバイス内に還元剤を含む溶液が充填された状態で一時的に通液が停止される、〔Ｂ１〕から〔Ｂ３〕のいずれか１つに記載の方法。
〔Ｂ５〕還元剤を含む溶液の通液量が、膜デバイス体積の約１倍（約１ＭＶ（Ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｖｏｌｕｍｅ））～約５００倍（約５００ＭＶ）である、〔Ｂ１〕から〔Ｂ４〕のいずれか１つに記載の方法。
〔Ｂ６〕還元剤を含む溶液の通液量が、膜デバイス体積の約２倍（約２ＭＶ）～約１００倍（約１００ＭＶ）、例えば約１５倍（約１５ＭＶ）である、〔Ｂ１〕から〔Ｂ５〕のいずれか１つに記載の方法。
〔Ｂ７〕前記混合物と還元剤を含む溶液とが、約６秒～約６００分接触される、〔Ｂ１〕から〔Ｂ６〕のいずれか１つに記載の方法。
〔Ｂ８〕前記混合物と還元剤を含む溶液とが、約１８秒～約１２０分、例えば約７．５分接触される、〔Ｂ１〕から〔Ｂ７〕のいずれか１つに記載の方法。
〔Ｂ９〕担体に担持された抗原結合分子の量が、膜デバイス体積１Ｌあたり、約５ｇ～約１００ｇ、または約７ｇ～約７０ｇ、例えば約２５ｇである、〔Ｂ１〕から〔Ｂ８〕のいずれか１つに記載の方法。
〔Ｂ１０〕還元剤を含まない溶液が、約２秒～約６０分の通過時間で膜デバイスを通液される、または、膜デバイス内に該溶液が充填された状態で一時的に通液が停止される、〔Ｂ１〕から〔Ｂ９〕のいずれか１つに記載の方法。
〔Ｂ１１〕還元剤を含まない溶液が、約３秒～約６分、例えば約３０秒の通過時間で膜デバイスを通液される、または、膜デバイス内に該溶液が充填された状態で一時的に通液が停止される、〔Ｂ１〕から〔Ｂ１０〕のいずれか１つに記載の方法。
〔Ｂ１２〕還元剤を含まない溶液の通液量が、膜デバイスの体積の約１倍（約１ＭＶ）～約５００倍（約５００ＭＶ）である、〔Ｂ１〕から〔Ｂ１１〕のいずれか１つに記載の方法。
〔Ｂ１３〕還元剤を含まない溶液の通液量が、膜デバイス体積の約２倍（約２ＭＶ）～約１００倍（約１００ＭＶ）、例えば約１５倍（約１５ＭＶ）である、〔Ｂ１〕から〔Ｂ１２〕のいずれか１つに記載の方法。
〔Ｂ１４〕前記混合物と還元剤を含まない溶液とが、約６秒～約６００分接触される、〔Ｂ１〕から〔Ｂ１３〕のいずれか１つに記載の方法。
〔Ｂ１５〕前記混合物と還元剤を含まない溶液とが、約１８秒～約１２０分、例えば約７．５分接触される、〔Ｂ１〕から〔Ｂ１４〕のいずれか１つに記載の方法。

　また本開示は、以下の発明に関する。
〔１０１〕抗原結合分子が、少なくとも１つのジスルフィド結合を介して互いに連結されることができる第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインを含む、〔１〕から〔５２〕、〔Ａ１〕から〔Ａ２４〕、および〔Ｂ１〕から〔Ｂ１５〕のいずれか１つに記載の方法。
〔１０２〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのそれぞれが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、またはＶＨＨ構造を有する、〔１０１〕に記載の方法。
〔１０３〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのそれぞれが、ヒンジ領域を含むか、またはヒンジ領域を含まない、〔１０１〕または〔１０２〕に記載の方法。
〔１０４〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインがそれぞれ、Ｆ（ａｂ’）２構造を形成する、Ｆａｂおよびヒンジ領域を含む、〔１０１〕から〔１０３〕のいずれか１つに記載の方法。
〔１０５〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインがいずれも同じ抗原に結合する、〔１０１〕から〔１０４〕のいずれか１つに記載の方法。
〔１０６〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインがいずれも同じ抗原上の同じエピトープに結合する、〔１０１〕から〔１０５〕のいずれか１つに記載の方法。
〔１０７〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインの各々が同じ抗原上の異なるエピトープに結合する、〔１０１〕から〔１０５〕のいずれか１つに記載の方法。
〔１０８〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインの各々が異なる抗原に結合する、〔１０１〕から〔１０４〕のいずれか１つに記載の方法。
〔１０９〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインがいずれも同じアミノ酸配列を有する、〔１０１〕から〔１０６〕のいずれか１つに記載の方法。
〔１１０〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインの各々が異なるアミノ酸配列を有する、〔１０１〕から〔１０８〕のいずれか１つに記載の方法。
〔１１１〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインの少なくとも１つが可溶性タンパク質に結合する、〔１０１〕から〔１１０〕のいずれか１つに記載の方法。
〔１１２〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインの少なくとも１つが膜タンパク質に結合する、〔１０１〕から〔１１１〕のいずれか１つに記載の方法。
〔１１３〕抗原結合分子が、２つの抗原分子間の相互作用を調節する活性を有する、〔１〕から〔５２〕、〔Ａ１〕から〔Ａ２４〕、〔Ｂ１〕から〔Ｂ１５〕、および〔１０１〕から〔１１２〕のいずれか１つに記載の方法。
〔１１４〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインがそれぞれリガンドおよびその受容体に結合し、かつ抗原結合分子が、リガンドによる受容体の活性化を促進する活性を有する、〔１０１〕から〔１０４〕のいずれか１つに記載の方法。
〔１１５〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインがそれぞれ酵素とその基質に結合し、かつ抗原結合分子が、酵素と基質との触媒反応を促進する活性を有する、〔１０１〕から〔１０４〕のいずれか１つに記載の方法。
〔１１６〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインがいずれも細胞表面上に存在するタンパク質（それぞれ、第一の抗原、および第二の抗原）に結合し、かつ抗原結合分子が、第一の抗原を発現する細胞と第二の抗原を発現する細胞との間の相互作用を促進する活性を有する、〔１０１〕から〔１０４〕のいずれか１つに記載の方法。
〔１１７〕第一の抗原を発現する細胞が細胞傷害活性を有する細胞であり、第二の抗原を発現する細胞がその標的となる細胞であり、かつ抗原結合分子が、前記細胞傷害活性を有する細胞による前記標的細胞の損傷を促進する、〔１１６〕に記載の方法。
〔１１８〕細胞傷害活性を有する細胞がＴ細胞、ＮＫ細胞、単球、またはマクロファージである、〔１１７〕に記載の方法。
〔１１９〕抗原が、サイトカイン受容体スーパーファミリーに属する受容体、Ｇタンパク質結合型受容体、イオンチャネル型受容体、チロシンキナーゼ型受容体、免疫チェックポイント受容体、抗原受容体、ＣＤ抗原、共刺激分子、および細胞接着分子からなる群より選択される、〔１０５〕から〔１１８〕のいずれか１つに記載の方法。
〔１２０〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインがそれぞれ、ＣＤ３および／またはＣＤ１３７に結合することができる、〔１０１〕から〔１０４〕のいずれか１つに記載の方法。
〔１２１〕抗原結合分子が、第三の抗原結合ドメインをさらに含む、〔１〕から〔５２〕、〔Ａ１〕から〔Ａ２４〕、〔Ｂ１〕から〔Ｂ１５〕、および〔１０１〕から〔１２０〕のいずれか１つに記載の方法。
〔１２２〕第三の抗原結合ドメインが、第一の抗原結合ドメインまたは第二の抗原結合ドメインのいずれか一方に融合されている、〔１０１〕から〔１２１〕のいずれか１つに記載の方法。
〔１２３〕第三の抗原結合ドメインがＦａｂまたはｓｃＦｖである、〔１２１〕または〔１２２〕に記載の方法。
〔１２４〕第三の抗原結合ドメインが、そのＣ末端で、第一の抗原結合ドメインまたは第二の抗原結合ドメインのいずれか一方のＦａｂ重鎖（ＶＨ領域）のＮ末端に、任意でペプチドリンカーを介して、融合されている、〔１０２〕から〔１２３〕のいずれか１つに記載の方法。
〔１２５〕第一の抗原結合ドメイン、第二の抗原結合ドメイン、および第三の抗原結合ドメインのそれぞれがＦａｂ分子であり、第三の抗原結合ドメインが、そのＦａｂ重鎖（ＣＨ１領域）のＣ末端で、第一の抗原結合ドメインまたは第二の抗原結合ドメインのいずれか一方のＦａｂ重鎖（ＶＨ領域）のＮ末端に、任意でペプチドリンカーを介して、融合されている、〔１２１〕から〔１２４〕のいずれか１つに記載の方法。
〔１２６〕ペプチドリンカーが、配列番号：18、配列番号：19、および配列番号：20に記載のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、〔１２４〕または〔１２５〕に記載の方法。
〔１２７〕第三の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ軽鎖およびＦａｂ重鎖の可変領域が交換されているクロスオーバーＦａｂ分子であり、かつ第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインが従来型のＦａｂ分子である、〔１２１〕から〔１２６〕のいずれか１つに記載の方法。
〔１２８〕第三の抗原結合ドメインが、がん細胞またはがん組織上に発現している抗原に結合することができる、〔１２１〕から〔１２７〕のいずれか１つに記載の方法。
〔１２９〕第三の抗原結合ドメインが、ＤＬＬ３、好ましくはヒトＤＬＬ３に結合できる、〔１２１〕から〔１２８〕のいずれか１つに記載の方法。
〔１３０〕抗原結合分子がＦｃ領域をさらに含む、〔１〕から〔５２〕、〔Ａ１〕から〔Ａ２４〕、〔Ｂ１〕から〔Ｂ１５〕、および〔１０１〕から〔１２９〕のいずれか１つに記載の方法。
〔１３１〕Ｆｃ領域が、安定な会合が可能な第１のＦｃ領域サブユニットおよび第２のＦｃ領域サブユニットで構成される、〔１３０〕に記載の方法。
〔１３２〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインがＦａｂであり、第一の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃ領域の第１のＦｃ領域サブユニットおよび第２のＦｃ領域サブユニットのいずれか一方のＮ末端に融合され、かつ第二の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃ領域の他方のサブユニットのＮ末端に融合されている、〔１３１〕に記載の方法。
〔１３３〕Ｆｃ領域がヒト由来である、〔１３０〕から〔１３２〕のいずれか１つに記載の方法。
〔１３４〕Ｆｃ領域が、ＩｇＧＦｃ領域、好ましくはヒトＩｇＧＦｃ領域、より好ましくはヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域である、〔１３０〕から〔１３３〕のいずれか１つに記載の方法。
〔１３５〕Ｆｃ領域が、天然型ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域と比較して、ヒトＦｃγ受容体に対して低下した結合アフィニティを示す、〔１３０〕から〔１３４〕のいずれか１つに記載の方法。
〔１３６〕Ｆｃ領域が、天然型ＩｇＧのＦｃ領域と比較して、酸性ｐＨ条件（例えば、ｐＨ５．８）下で増強されたＦｃＲｎ結合活性を示す、〔１３０〕から〔１３５〕のいずれか１つに記載の方法。
〔１３７〕Ｆｃ領域が、EUナンバリングによる、434位にAla；438位にGlu、Arg、Ser、またはLys；および440位にGlu、Asp、またはGlnを含む、〔１３０〕から〔１３６〕のいずれか１つに記載の方法。
〔１３８〕Ｆｃ領域が、EUナンバリングによる、434位にAla；438位にArgまたはLys；および440位にGluまたはAspを含む、〔１３０〕から〔１３７〕のいずれか１つに記載の方法。
〔１３９〕Ｆｃ領域が、EUナンバリングによる、428位にIleもしくはLeu；および/または436位にIle、Leu、Val、Thr、もしくはPheをさらに含む、〔１３０〕から〔１３８〕のいずれか１つに記載の方法。
〔１４０〕Ｆｃ領域が、EUナンバリングによる、以下：
　（a）N434A/Q438R/S440E；
　（b）N434A/Q438R/S440D；
　（c）N434A/Q438K/S440E；
　（d）N434A/Q438K/S440D；
　（e）N434A/Y436T/Q438R/S440E；
　（f）N434A/Y436T/Q438R/S440D；
　（g）N434A/Y436T/Q438K/S440E；
　（h）N434A/Y436T/Q438K/S440D；
　（i）N434A/Y436V/Q438R/S440E；
　（j）N434A/Y436V/Q438R/S440D；
　（k）N434A/Y436V/Q438K/S440E；
　（l）N434A/Y436V/Q438K/S440D；
　（m）N434A/R435H/F436T/Q438R/S440E；
　（n）N434A/R435H/F436T/Q438R/S440D；
　（o）N434A/R435H/F436T/Q438K/S440E；
　（p）N434A/R435H/F436T/Q438K/S440D；
　（q）N434A/R435H/F436V/Q438R/S440E；
　（r）N434A/R435H/F436V/Q438R/S440D；
　（s）N434A/R435H/F436V/Q438K/S440E；
　（t）N434A/R435H/F436V/Q438K/S440D；
　（u）M428L/N434A/Q438R/S440E；
　（v）M428L/N434A/Q438R/S440D；
　（w）M428L/N434A/Q438K/S440E；
　（x）M428L/N434A/Q438K/S440D；
　（y）M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E；
　（z）M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440D；
　（aa）M428L/N434A/Y436T/Q438K/S440E；
　（ab）M428L/N434A/Y436T/Q438K/S440D；
　（ac）M428L/N434A/Y436V/Q438R/S440E；
　（ad）M428L/N434A/Y436V/Q438R/S440D；
　（ae）M428L/N434A/Y436V/Q438K/S440E；
　（af）M428L/N434A/Y436V/Q438K/S440D；
　（ag）L235R/G236R/S239K/M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E；および
　（ah）L235R/G236R/A327G/A330S/P331S/M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E
からなる群より選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含む、〔１３０〕から〔１３９〕のいずれか１つに記載の方法。
〔１４１〕Ｆｃ領域が、M428L/N434A/Q438R/S440Eのアミノ酸置換の組み合わせを含む、〔１３０〕から〔１３６〕のいずれか１つに記載の方法。
〔１４２〕Ｆｃ領域が、Ｆｃ領域の多量体化を促進する１つ以上のアミノ酸置換の組み合わせを含む、〔１３０〕から〔１４１〕のいずれか１つに記載の方法。
〔１４３〕多量体化を促進するアミノ酸置換が、ＥＵナンバリング２４７位、２４８位、２５３位、２５４位、３１０位、３１１位、３３８位、３４５位、３５６位、３５９位、３８２位、３８５位、３８６位、４３０位、４３３位、４３４位、４３６位、４３７位、４３８位、４３９位、４４０位、および４４７位からなる群より選択される少なくとも１つの部位におけるアミノ酸置換を含む、〔１４２〕に記載の方法。
〔１４４〕多量体化が六量体化である、〔１４２〕または〔１４３〕に記載の方法。
〔１４５〕抗原結合分子が、そのヒンジ領域内において、システイン残基のうちの少なくとも１つが置換されたアミノ酸残基を有する、〔１〕から〔５２〕、〔Ａ１〕から〔Ａ２４〕、〔Ｂ１〕から〔Ｂ１５〕、および〔１０１〕から〔１４４〕のいずれか１つに記載の方法。
〔１４６〕システイン残基がヒンジ領域のＥＵナンバリング２２６位および／または２２９位に存在する、〔１４５〕に記載の方法。
〔１４７〕抗原結合分子が多重特異性抗原結合分子である、〔１〕から〔５２〕、〔Ａ１〕から〔Ａ２４〕、〔Ｂ１〕から〔Ｂ１５〕、および〔１０１〕から〔１４６〕のいずれか１つに記載の方法。
〔１４８〕多重特異性抗原結合分子が二重特異性抗原結合分子または三重特異性抗原結合分子である、〔１４７〕に記載の方法。
〔１４９〕抗原結合分子が抗体である、〔１〕から〔５２〕、〔Ａ１〕から〔Ａ２４〕、〔Ｂ１〕から〔Ｂ１５〕、および〔１０１〕から〔１４８〕のいずれか１つに記載の方法。
〔１５０〕抗体がＩｇＧ抗体、好ましくはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体である、〔１４９〕に記載の方法。

　また本開示は、以下の発明に関する。
〔２０１〕ヒンジ領域以外の領域における少なくとも１つのジスルフィド結合が、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのそれぞれ同じ位置に存在するアミノ酸残基との間で形成される、〔１０１〕から〔１５０〕のいずれか１つに記載の方法。
〔２０２〕ヒンジ領域以外の領域における少なくとも１つのジスルフィド結合が、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのそれぞれ異なる位置に存在するアミノ酸残基との間で形成される、〔１０１〕から〔１５０〕のいずれか１つに記載の方法。
〔２０３〕ヒンジ領域以外の領域における少なくとも１つのジスルフィド結合が、第一の抗原結合ドメインの重鎖と第二の抗原結合ドメインの重鎖との間、第一の抗原結合ドメインの軽鎖と第二の抗原結合ドメインの軽鎖との間、または、第一の抗原結合ドメインのＣＨ１領域、ＣＬ領域、ＶＬ領域、ＶＨ領域、もしくはＶＨＨ領域と、第二の抗原結合ドメインのＣＨ１領域、ＣＬ領域、ＶＬ領域、ＶＨ領域、もしくはＶＨＨ領域の任意の組み合わせとの間で形成される、〔１０１〕から〔１５０〕、〔２０１〕および〔２０２〕のいずれか１つに記載の方法。
〔２０４〕少なくとも１つのジスルフィド結合が、第一の抗原結合ドメインのＣＨ１領域と第二の抗原結合ドメインのＣＨ１領域との間で形成される、〔２０３〕に記載の方法。
〔２０５〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるアミノ酸残基の位置が、ＥＵナンバリング１１９位から１２３位、１３１位から１４０位、１４８位から１５０位、１５５位から１６７位、１７４位から１７８位、１８８位から１９７位、２０１位から２１４位、および２１８位から２１９位からなる群よりそれぞれ独立に選択される、〔２０４〕に記載の方法。
〔２０６〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるアミノ酸残基の位置が、ＥＵナンバリング１１９位、１２２位、１２３位、１３１位、１３２位、１３３位、１３４位、１３５位、１３６位、１３７位、１３８位、１３９位、１４０位、１４８位、１５０位、１５５位、１５６位、１５７位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１６４位、１６５位、１６７位、１７４位、１７６位、１７７位、１７８位、１８８位、１８９位、１９０位、１９１位、１９２位、１９３位、１９４位、１９５位、１９６位、１９７位、２０１位、２０３位、２０５位、２０６位、２０７位、２０８位、２１１位、２１２位、２１３位、２１４位、２１８位、および２１９位からなる群よりそれぞれ独立に選択される、〔２０４〕に記載の方法。
〔２０７〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるアミノ酸残基の位置が、ＥＵナンバリング１３４位、１３５位、１３６位、１３７位、１９１位、１９２位、１９３位、１９４位、１９５位、および１９６位からなる群よりそれぞれ独立に選択される、〔２０４〕に記載の方法。
〔２０８〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるアミノ酸残基の位置が、ＥＵナンバリング１３５位、１３６位、および１９１位からなる群よりそれぞれ独立に選択される、〔２０４〕に記載の方法。
〔２０９〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるアミノ酸残基の位置が、ＥＵナンバリング１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、および１２３位からなる群よりそれぞれ独立に選択される、〔２０４〕に記載の方法。
〔２１０〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるアミノ酸残基の位置が、ＥＵナンバリング１３１位、１３２位、１３３位、１３４位、１３５位、１３６位、１３７位、１３８位、１３９位、および１４０位からなる群よりそれぞれ独立に選択される、〔２０４〕に記載の方法。
〔２１１〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるアミノ酸残基の位置が、ＥＵナンバリング１４８位、１４９位、および１５０位からなる群よりそれぞれ独立に選択される、〔２０４〕に記載の方法。
〔２１２〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるアミノ酸残基の位置が、ＥＵナンバリング１５５位、１５６位、１５７位、１５８位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１６４位、１６５位、１６６位、および１６７位からなる群よりそれぞれ独立に選択される、〔２０４〕に記載の方法。
〔２１３〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるアミノ酸残基の位置が、ＥＵナンバリング１７４位、１７５位、１７６位、１７７位、および１７８位からなる群よりそれぞれ独立に選択される、〔２０４〕に記載の方法。
〔２１４〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるアミノ酸残基の位置が、ＥＵナンバリング１８８位、１８９位、１９０位、１９１位、１９２位、１９３位、１９４位、１９５位、１９６位、および１９７位からなる群よりそれぞれ独立に選択される、〔２０４〕に記載の方法。
〔２１５〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるアミノ酸残基の位置が、ＥＵナンバリング２０１位、２０２位、２０３位、２０４位、２０５位、２０６位、２０７位、２０８位、２０９位、２１０位、２１１位、２１２位、２１３位、および２１４位からなる群よりそれぞれ独立に選択される、〔２０４〕に記載の方法。
〔２１６〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるアミノ酸残基の位置が、ＥＵナンバリング２１８位および２１９位からなる群よりそれぞれ独立に選択される、〔２０４〕に記載の方法。
〔２１７〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるアミノ酸残基の位置の差が３アミノ酸以内である、〔２０４〕から〔２１６〕のいずれか１つに記載の方法。
〔２１８〕第一の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるアミノ酸残基が、ＥＵナンバリング１３５位にあるアミノ酸残基であり、第二の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるアミノ酸残基が、ＥＵナンバリング１３２位から１３８位のいずれか１つにあるアミノ酸残基である、〔２０４〕に記載の方法。
〔２１９〕第一の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるアミノ酸残基が、ＥＵナンバリング１３６位にあるアミノ酸残基であり、第二の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるアミノ酸残基が、ＥＵナンバリング１３３位から１３９位のいずれか１つにあるアミノ酸残基である、〔２０４〕に記載の方法。
〔２２０〕第一の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるアミノ酸残基が、ＥＵナンバリング１９１位にあるアミノ酸残基であり、第二の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるアミノ酸残基が、ＥＵナンバリング１８８位から１９４位のいずれか１つにあるアミノ酸残基である、〔２０４〕に記載の方法。
〔２２１〕第一の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるアミノ酸残基が、ＥＵナンバリング１３５位にあるアミノ酸残基であり、第二の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるアミノ酸残基が、ＥＵナンバリング１３５位にあるアミノ酸残基である、〔２０４〕に記載の方法。
〔２２２〕第一の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるアミノ酸残基が、ＥＵナンバリング１３６位にあるアミノ酸残基であり、第二の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるアミノ酸残基が、ＥＵナンバリング１３６位にあるアミノ酸残基である、〔２０４〕に記載の方法。
〔２２３〕第一の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるアミノ酸残基が、ＥＵナンバリング１９１位にあるアミノ酸残基であり、第二の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるアミノ酸残基が、ＥＵナンバリング１９１位にあるアミノ酸残基である、〔２０４〕に記載の方法。
〔２２４〕ＣＨ１領域のサブクラスが、γ１、γ２、γ３、γ４、α１、α２、μ、δ、またはεである、〔２０４〕から〔２２３〕のいずれか１つに記載の方法。
〔２２５〕抗原結合分子が第一の抗原結合ドメインと第二の抗原結合ドメインとの間に１つ、２つまたはそれより多くの追加のジスルフィド結合を含み、前記追加のジスルフィド結合が、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインの各ＣＨ１領域におけるＥＵナンバリングに従う以下の位置にあるアミノ酸残基を介して形成される、〔１０１〕から〔１５０〕、および〔２０１〕から〔２２４〕のいずれか１つに記載の方法：
（ａ）２つの抗原結合ドメインの各々における１３１位から１３８位、１９４位および１９５位のいずれかの位置にあるアミノ酸残基間；
（ｂ）２つの抗原結合ドメインの各々における１３１位にあるアミノ酸残基間、および２つの抗原結合ドメインの各々における１９４位にあるアミノ酸残基間；
（ｃ）２つの抗原結合ドメインの各々における１３２位にあるアミノ酸残基間、および２つの抗原結合ドメインの各々における１９４位にあるアミノ酸残基間；
（ｄ）２つの抗原結合ドメインの各々における１３３位にあるアミノ酸残基間、および２つの抗原結合ドメインの各々における１９４位にあるアミノ酸残基間；
（ｅ）２つの抗原結合ドメインの各々における１３４位にあるアミノ酸残基間、および２つの抗原結合ドメインの各々における１９４位にあるアミノ酸残基間；
（ｆ）２つの抗原結合ドメインの各々における１３５位にあるアミノ酸残基間、および２つの抗原結合ドメインの各々における１９４位にあるアミノ酸残基間；
（ｇ）２つの抗原結合ドメインの各々における１３６位にあるアミノ酸残基間、および２つの抗原結合ドメインの各々における１９４位にあるアミノ酸残基間；
（ｈ）２つの抗原結合ドメインの各々における１３７位にあるアミノ酸残基間、および２つの抗原結合ドメインの各々における１９４位にあるアミノ酸残基間；
（ｉ）２つの抗原結合ドメインの各々における１３８位にあるアミノ酸残基間、および２つの抗原結合ドメインの各々における１９４位にあるアミノ酸残基間；
（ｊ）２つの抗原結合ドメインの各々における１３１位にあるアミノ酸残基間、および２つの抗原結合ドメインの各々における１９５位にあるアミノ酸残基間；
（ｋ）２つの抗原結合ドメインの各々における１３２位にあるアミノ酸残基間、および２つの抗原結合ドメインの各々における１９５位にあるアミノ酸残基間；
（ｌ）２つの抗原結合ドメインの各々における１３３位にあるアミノ酸残基間、および２つの抗原結合ドメインの各々における１９５位にあるアミノ酸残基間；
（ｍ）２つの抗原結合ドメインの各々における１３４位にあるアミノ酸残基間、および２つの抗原結合ドメインの各々における１９５位にあるアミノ酸残基間；
（ｎ）２つの抗原結合ドメインの各々における１３５位にあるアミノ酸残基間、および２つの抗原結合ドメインの各々における１９５位にあるアミノ酸残基間；
（ｏ）２つの抗原結合ドメインの各々における１３６位にあるアミノ酸残基間、および２つの抗原結合ドメインの各々における１９５位にあるアミノ酸残基間；
（ｐ）２つの抗原結合ドメインの各々における１３７位にあるアミノ酸残基間、および２つの抗原結合ドメインの各々における１９５位にあるアミノ酸残基間；ならびに
（ｑ）２つの抗原結合ドメインの各々における１３８位にあるアミノ酸残基間、および２つの抗原結合ドメインの各々における１９５位にあるアミノ酸残基間。
〔２２６〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのいずれか一方が、ＣＨ１領域におけるＥＵナンバリング１３６位～１３８位に１つ、２つまたはそれより多くの荷電アミノ酸残基を含み；かつ第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインの他方が、ＣＨ１領域におけるＥＵナンバリング１９３位～１９５位に１つ、２つまたはそれより多くの逆に荷電したアミノ酸残基を含む、〔１０１〕から〔１５０〕、および〔２０１〕から〔２２４〕のいずれか１つに記載の方法。
〔２２７〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのいずれか一方が、ＣＨ１領域におけるＥＵナンバリング１３６位～１３８位に１つ、２つまたはそれより多くの正に荷電したアミノ酸残基を含み；かつ第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインの他方が、ＣＨ１領域におけるＥＵナンバリング１９３位～１９５位に１つ、２つまたはそれより多くの負に荷電したアミノ酸残基を含む、〔１０１〕から〔１５０〕、および〔２０１〕から〔２２４〕のいずれか１つに記載の方法。
〔２２８〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのいずれか一方が、ＣＨ１領域におけるＥＵナンバリング１３６位～１３８位に１つ、２つまたはそれより多くの負に荷電したアミノ酸残基を含み；かつ第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインの他方が、ＣＨ１領域におけるＥＵナンバリング１９３位～１９５位に１つ、２つまたはそれより多くの正に荷電したアミノ酸残基を含む、〔１０１〕から〔１５０〕、および〔２０１〕から〔２２４〕のいずれか１つに記載の方法。
〔２２９〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのいずれか一方が、ＣＨ１領域において以下のアミノ酸残基：
（ａ）ＥＵナンバリング１３６位にあるアミノ酸残基がグルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）である；
（ｂ）ＥＵナンバリング１３７位にあるアミノ酸残基がグルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）である；
（ｃ）ＥＵナンバリング１３８位にあるアミノ酸残基がグルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）である
の１つ、２つまたはそれより多くを含み；かつ
　第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインの他方が、ＣＨ１領域において以下のアミノ酸残基：
（ｄ）ＥＵナンバリング１９３位にあるアミノ酸残基がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）である；
（ｅ）ＥＵナンバリング１９４位にあるアミノ酸残基がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）である；および
（ｆ）ＥＵナンバリング１９５位にあるアミノ酸残基がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）である
の１つ、２つまたはそれより多くを含む、〔１０１〕から〔１５０〕、および〔２０１〕から〔２２４〕のいずれか１つに記載の方法。
〔２３０〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのいずれか一方が、ＣＨ１領域において以下のアミノ酸残基：
（ａ）ＥＵナンバリング１３６位にあるアミノ酸残基がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）である；
（ｂ）ＥＵナンバリング１３７位にあるアミノ酸残基がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）である；
（ｃ）ＥＵナンバリング１３８位にあるアミノ酸残基がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）である
の１つ、２つまたはそれより多くを含み；かつ
　第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインの他方が、ＣＨ１領域において以下のアミノ酸残基：
（ｄ）ＥＵナンバリング１９３位にあるアミノ酸残基がグルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）である；
（ｅ）ＥＵナンバリング１９４位にあるアミノ酸残基がグルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）である；および
（ｆ）ＥＵナンバリング１９５位にあるアミノ酸残基がグルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）である
の１つ、２つまたはそれより多くを含む、〔１０１〕から〔１５０〕、および〔２０１〕から〔２２４〕のいずれか１つに記載の方法。
〔２３１〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインの各々が、表１、表２、または表３に記載された、ＣＨ１領域における（ＥＵナンバリングに従う）特定の荷電アミノ酸の変異の組み合わせのいずれかを含む、〔１０１〕から〔１５０〕、および〔２０１〕から〔２２４〕のいずれか１つに記載の方法。
〔２３２〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのいずれか一方が、ＣＨ１領域におけるＥＵナンバリング１３６位～１３８位に１つ、２つまたはそれより多くの疎水性アミノ酸残基を含み；かつ第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインの他方が、ＣＨ１領域におけるＥＵナンバリング１９３位～１９５位に１つ、２つまたはそれより多くの疎水性アミノ酸残基を含む、〔１０１〕から〔１５０〕、および〔２０１〕から〔２２４〕のいずれか１つに記載の方法。
〔２３３〕疎水性アミノ酸残基が、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、および／またはトリプトファン（Ｔｒｐ）である、〔２３２〕に記載の方法。
〔２３４〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインの各々が、表４に記載された、ＣＨ１領域における（ＥＵナンバリングに従う）特定の疎水性アミノ酸の変異の組み合わせのいずれかを含む、〔１０１〕から〔１５０〕、および〔２０１〕から〔２２４〕のいずれか１つに記載の方法。
〔２３５〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのいずれか一方が、ＣＨ１領域におけるＥＵナンバリング１３６位～１３８位に１つの「ノブ（ｋｎｏｂ）」アミノ酸残基を含み；かつ第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインの他方が、ＣＨ１領域におけるＥＵナンバリング１９３位～１９５位に１つ、２つまたはそれより多くの「ホール（ｈｏｌｅ）」アミノ酸残基を含む、〔１０１〕から〔１５０〕、および〔２０１〕から〔２２４〕のいずれか１つに記載の方法。
〔２３６〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのいずれか一方が、ＣＨ１領域におけるＥＵナンバリング１３６位～１３８位に１つ、２つまたはそれより多くの「ホール」アミノ酸残基を含み；かつ第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインの他方が、ＣＨ１領域におけるＥＵナンバリング１９３位～１９５位に１つの「ノブ」アミノ酸残基を含む、〔１０１〕から〔１５０〕、および〔２０１〕から〔２２４〕のいずれか１つに記載の方法。
〔２３７〕「ノブ」アミノ酸残基が、トリプトファン（Ｔｒｐ）およびフェニルアラニン（Ｐｈｅ）からなる群より選択され；かつ「ホール」アミノ酸残基が、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、およびセリン（Ｓｅｒ）からなる群より選択される、〔２３６〕に記載の方法。
〔２３８〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのいずれか一方が、ＣＨ１領域におけるＥＵナンバリング１３６位～１３８位に１つ、２つまたはそれより多くの芳香族アミノ酸残基を含み；かつ第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインの他方が、ＣＨ１領域におけるＥＵナンバリングの１９３位～１９５位に１つ、２つまたはそれより多くの正に荷電したアミノ酸残基を含む、〔１０１〕から〔１５０〕、および〔２０１〕から〔２２４〕のいずれか１つに記載の方法。
〔２３９〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのいずれか一方が、ＣＨ１領域におけるＥＵナンバリング１３６位～１３８位に１つ、２つまたはそれより多くの正に荷電したアミノ酸残基を含み；かつ第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインの他方が、ＣＨ１領域におけるＥＵナンバリング１９３位～１９５位に１つ、２つまたはそれより多くの芳香族アミノ酸残基を含む、〔１０１〕から〔１５０〕、および〔２０１〕から〔２２４〕のいずれか１つに記載の方法。
〔２４０〕芳香族アミノ酸残基が、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、およびフェニルアラニン（Ｐｈｅ）からなる群より選択され；かつ正に荷電したアミノ酸残基が、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、およびヒスチジン（Ｈｉｓ）からなる群より選択される、〔１０１〕から〔１５０〕、および〔２０１〕から〔２２４〕のいずれか１つに記載の方法。
〔２４１〕ヒンジ領域以外の領域における少なくとも１つのジスルフィド結合が、第一の抗原結合ドメインのＣＬ領域と第二の抗原結合ドメインのＣＬ領域との間で形成される、〔２０３〕に記載の方法。
〔２４２〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのＣＬ領域におけるアミノ酸残基の位置が、Ｋａｂａｔナンバリング１０８位から１１２位、１２１位から１２８位、１５１位から１５６位、１８４位から１９０位、１９５位から１９６位、２００位から２０３位、および２０８位から２１３位からなる群よりそれぞれ独立に選択される、〔２４１〕に記載の方法。
〔２４３〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのＣＬ領域におけるアミノ酸残基の位置が、Ｋａｂａｔナンバリング１０８位、１０９位、１１２位、１２１位、１２３位、１２６位、１２８位、１５１位、１５２位、１５３位、１５６位、１８４位、１８６位、１８８位、１８９位、１９０位、１９５位、１９６位、２００位、２０１位、２０２位、２０３位、２０８位、２１０位、２１１位、２１２位、および２１３位からなる群よりそれぞれ独立に選択される、〔２４１〕に記載の方法。
〔２４４〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのＣＬ領域におけるアミノ酸残基の位置が、Ｋａｂａｔナンバリング１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、および１１２位からなる群よりそれぞれ独立に選択される、〔２４１〕に記載の方法。
〔２４５〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのＣＬ領域におけるアミノ酸残基の位置が、Ｋａｂａｔナンバリング１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、および１２８位からなる群よりそれぞれ独立に選択される、〔２４１〕に記載の方法。
〔２４６〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのＣＬ領域におけるアミノ酸残基の位置が、Ｋａｂａｔナンバリング１５１位、１５２位、１５３位、１５４位、１５５位、および１５６位からなる群よりそれぞれ独立に選択される、〔２４１〕に記載の方法。
〔２４７〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのＣＬ領域におけるアミノ酸残基の位置が、Ｋａｂａｔナンバリング１８４位、１８５位、１８６位、１８７位、１８８位、１８９位、および１９０位からなる群よりそれぞれ独立に選択される、〔２４１〕に記載の方法。
〔２４８〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのＣＬ領域におけるアミノ酸残基の位置が、Ｋａｂａｔナンバリング１９５位および１９６位からなる群よりそれぞれ独立に選択される、〔２４１〕に記載の方法。
〔２４９〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのＣＬ領域におけるアミノ酸残基の位置が、Ｋａｂａｔナンバリング２００位、２０１位、２０２位、および２０３位からなる群よりそれぞれ独立に選択される、〔２４１〕に記載の方法。
〔２５０〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのＣＬ領域におけるアミノ酸残基の位置が、Ｋａｂａｔナンバリング２０８位、２０９位、２１０位、２１１位、２１２位、および２１３位からなる群よりそれぞれ独立に選択される、〔２４１〕に記載の方法。
〔２５１〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのＣＬ領域におけるアミノ酸残基の位置の差が３アミノ酸以内である、〔２４１〕から〔２５０〕に記載の方法。
〔２５２〕第一の抗原結合ドメインのＣＬ領域におけるアミノ酸残基が、Ｋａｂａｔナンバリング１２６位にあるアミノ酸残基であり、第二の抗原結合ドメインのＣＬ領域におけるアミノ酸残基が、Ｋａｂａｔナンバリング１２６位にあるアミノ酸残基である、〔２４１〕に記載の方法。
〔２５３〕ヒンジ領域以外の領域における少なくとも１つのジスルフィド結合が、第一の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるアミノ酸残基と第二の抗原結合ドメインのＣＬ領域におけるアミノ酸残基との間で形成される、〔２０３〕に記載の方法。
〔２５４〕ＣＨ１領域におけるアミノ酸残基の位置が、ＥＵナンバリング１８８位、１８９位、１９０位、１９１位、１９２位、１９３位、１９４位、１９５位、１９６位、および１９７位からなる群より選択され、かつＣＬ領域におけるアミノ酸残基の位置が、Ｋａｂａｔナンバリング１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、および１２８位からなる群より選択される、〔２５３〕に記載の方法。
〔２５５〕ＣＨ１領域におけるアミノ酸残基が、ＥＵナンバリング１９１位にあるアミノ酸残基であり、ＣＬ領域におけるアミノ酸残基が、Ｋａｂａｔナンバリング１２６位にあるアミノ酸残基である、〔２５３〕に記載の方法。
〔２５６〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのそれぞれが、ＣＬ領域のＫａｂａｔナンバリング１２３位および／または１２４位において独立してリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）を有し、かつＣＨ１領域のＥＵナンバリング１４７位および/または２１３位において独立してグルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）を有する、〔１０１〕から〔１５０〕、および〔２０１〕から〔２２４〕のいずれか１つに記載の方法。
〔２５７〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのそれぞれが、ＣＬ領域のＫａｂａｔナンバリング１２３位および１２４位においてそれぞれアルギニン（Ｒ）およびリジン（Ｋ）を有し、かつＣＨ１領域のＥＵナンバリング１４７位および２１３位においてグルタミン酸（Ｅ）を有する、〔２５５〕に記載の方法。
〔２５８〕ＣＬ領域のサブクラスがκまたはλである、〔２４１〕から〔２５７〕に記載の方法。
〔２５９〕ヒンジ領域以外の領域における少なくとも１つのジスルフィド結合が、第一の抗原結合ドメインのＶＨ領域におけるアミノ酸残基と第二の抗原結合ドメインのＶＨ領域におけるアミノ酸残基との間で形成される、〔２０３〕に記載の方法。
〔２６０〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのＶＨ領域におけるアミノ酸残基の位置が、ＥＵナンバリング６位、８位、１６位、２０位、２５位、２６位、２８位、７４位、および８２ｂ位からなる群よりそれぞれ独立に選択される、〔２５９〕に記載の方法。
〔２６１〕ヒンジ領域以外の領域における少なくとも１つのジスルフィド結合が、第一の抗原結合ドメインのＶＬ領域におけるアミノ酸残基と第二の抗原結合ドメインのＶＬ領域におけるアミノ酸残基との間で形成される、〔２０３〕に記載の方法。
〔２６２〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのＶＬ領域（サブクラスκ）におけるアミノ酸残基の位置が、Ｋａｂａｔナンバリング２１位、２７位、５８位、７７位、１００位、１０５位、および１０７位からなる群よりそれぞれ独立に選択される、〔２６１〕に記載の方法。
〔２６３〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのＶＬ領域（サブクラスλ）におけるアミノ酸残基の位置が、Ｋａｂａｔナンバリング６位、１９位、３３位、および３４位からなる群よりそれぞれ独立に選択される、〔２６１〕に記載の方法。
〔２６４〕ヒンジ領域以外の領域における少なくとも１つのジスルフィド結合が、第一の抗原結合ドメインのＶＨＨ領域におけるアミノ酸残基と第二の抗原結合ドメインのＶＨＨ領域におけるアミノ酸残基との間で形成される、〔２０３〕に記載の方法。
〔２６５〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのＶＨＨ領域におけるアミノ酸残基の位置が、Ｋａｂａｔナンバリング４位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１４位、１５位、１７位、２０位、２４位、２７位、２９位、３８位、３９位、４０位、４１位、４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、６７位、６９位、７１位、７８位、８０位、８２位、８２ｃ位、８５位、８８位、９１位、９３位、９４位、および１０７位からなる群よりそれぞれ独立に選択される、〔２６４〕に記載の方法。

　また本開示は、以下の発明に関する。
〔３０１〕抗原結合分子が、CD3およびCD137に結合できるが、CD3およびCD137に同時には結合しない、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメイン、およびDLL3、好ましくはヒトDLL3に結合できる第三の抗原結合ドメインを含む、〔１〕から〔５２〕、〔Ａ１〕から〔Ａ２４〕、〔Ｂ１〕から〔Ｂ１５〕、〔１０１〕から〔１５０〕、および〔２０１〕から〔２６５〕のいずれか１つに記載の方法。
〔３０２〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのそれぞれが、同じかまたは異なり得る抗体可変領域を含み、かつ、以下の（a1）～（a4）：
（a1）配列番号：27に記載のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域（CDR）1、
　　　配列番号：28に記載のアミノ酸配列を含む重鎖CDR 2、および
　　　配列番号：29に記載のアミノ酸配列を含む重鎖CDR 3
　　　を含む重鎖可変領域、および、
　　　配列番号：30に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR 1、
　　　配列番号：31に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR 2、および
　　　配列番号：32に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR 3
　　　を含む軽鎖可変領域
　　　を含む、抗体可変領域；
（a2）配列番号：33に記載のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域（CDR）1、
　　　配列番号：34に記載のアミノ酸配列を含む重鎖CDR 2、および
　　　配列番号：35に記載のアミノ酸配列を含む重鎖CDR 3
　　　を含む重鎖可変領域、および、
　　　配列番号：30に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR 1、
　　　配列番号：31に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR 2、および
　　　配列番号：32に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR 3
　　　を含む軽鎖可変領域
　　　を含む、抗体可変領域；
（a3）（a1）または（a2）に記載の抗体可変領域が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体可変領域；ならびに
（a4）（a1）または（a2）に記載の抗体可変領域と抗原に対する結合が競合する抗体可変領域
からなる群より独立して選択される抗体可変領域を含む、〔３０１〕に記載の方法。
〔３０３〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのそれぞれが、同じかまたは異なり得る抗体可変領域を含み、かつ、以下の（a1）～（a4）：
（a1）配列番号：36に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
　　　配列番号：37に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
　　　を含む、抗体可変領域；および
（a2）配列番号：38に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
　　　配列番号：37に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
　　　を含む、抗体可変領域；
（a3）（a1）または（a2）に記載の抗体可変領域が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体可変領域；ならびに
（a4）（a1）または（a2）に記載の抗体可変領域と抗原に対する結合が競合する抗体可変領域
からなる群より独立して選択される抗体可変領域を含む、〔３０１〕または〔３０２〕に記載の方法。
〔３０４〕第三の抗原結合ドメインが、以下の（a1）～（a4）のいずれか1つ：
（a1）配列番号：46に記載のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域（CDR）1、
　　　配列番号：47に記載のアミノ酸配列を含む重鎖CDR 2、および
　　　配列番号：48に記載のアミノ酸配列を含む重鎖CDR 3
　　　を含む重鎖可変領域、および、
　　　配列番号：49に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR 1、
　　　配列番号：50に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR 2、および
　　　配列番号：51に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR 3
　　　を含む軽鎖可変領域を含む、
　　　抗体可変領域；
（a2）配列番号：52に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および、
　　　配列番号：53に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
　　　を含む、抗体可変領域；
（a3）（a1）または（a2）に記載の抗体可変領域が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体可変領域；ならびに
（a4）（a1）または（a2）に記載の抗体可変領域と抗原に対する結合が競合する抗体可変領域
からなる群より独立して選択される抗体可変領域を含む、〔３０１〕から〔３０３〕のいずれか１つに記載の方法。
〔３０５〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのそれぞれが、
配列番号：27に記載のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域（CDR）1、
配列番号：28に記載のアミノ酸配列を含む重鎖CDR 2、および
配列番号：29に記載のアミノ酸配列を含む重鎖CDR 3
を含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号：30に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR 1、
配列番号：31に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR 2、および
配列番号：32に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR 3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体可変領域を含む、〔３０１〕から〔３０４〕のいずれか１つに記載の方法。
〔３０６〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのそれぞれが、
配列番号：36に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
配列番号：37に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体可変領域を含む、〔３０１〕から〔３０５〕のいずれか１つに記載の方法。
〔３０７〕第三の抗原結合ドメインが、
配列番号：46に記載のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域（CDR）1、
配列番号：47に記載のアミノ酸配列を含む重鎖CDR 2、および
配列番号：48に記載のアミノ酸配列を含む重鎖CDR 3
を含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号：49に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR 1、
配列番号：50に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR 2、および
配列番号：51に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR 3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体可変領域を含む、〔３０１〕から〔３０６〕のいずれか１つに記載の方法。
〔３０８〕第三の抗原結合ドメインが、
配列番号：52に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
配列番号：53に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体可変領域を含む、〔３０１〕から〔３０７〕のいずれか１つに記載の方法。
〔３０９〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのそれぞれが、
配列番号：36のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
配列番号：37のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体可変領域を含み、かつ、
　第三の抗原結合ドメインが、
配列番号：52を含む重鎖可変領域、および
配列番号：53を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体可変領域を含む、〔３０１〕から〔３０８〕のいずれか１つに記載の方法。
〔３１０〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのそれぞれが、重鎖のEUナンバリング191位にシステイン残基を有するFabであり、かつ2つのシステイン残基によって形成されたジスルフィド結合を有する、〔３０１〕から〔３０９〕のいずれか１つに記載の方法。
〔３１１〕第一の、第二の、および第三の抗原結合ドメインのそれぞれが、VH領域およびCH1領域を含む重鎖と、VL領域およびCL領域を含む軽鎖とを含むFabであり、第三の抗原結合ドメインの重鎖のCH1領域のC末端が、第一の抗原結合ドメインまたは第二の抗原結合ドメインのいずれか一方のFab重鎖のVH領域のN末端に、直接またはペプチドリンカーを介して、融合されている、〔３０１〕から〔３１０〕のいずれか１つに記載の方法。
〔３１２〕ペプチドリンカーが、配列番号：18、配列番号：19、および配列番号：20に記載のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、〔３１１〕に記載の方法。
〔３１３〕第三の抗原結合ドメインが、VH領域がCL領域に連結されVL領域がCH1領域に連結されたクロスオーバーFabであり、かつ第一のおよび第二の抗原結合ドメインの各々が、VH領域がCH1領域に連結されVL領域がCL領域に連結された従来型のFabである、〔３０１〕から〔３１２〕のいずれか１つに記載の方法。
〔３１４〕第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインそれぞれのCL領域において、Kabatナンバリング123位および124位のアミノ酸残基がそれぞれ、アルギニンおよびリジンであり、第一のおよび第二の抗原結合ドメインそれぞれのCH1領域において、EUナンバリング147位および213位のアミノ酸残基がグルタミン酸である、〔３０１〕から〔３１３〕のいずれか１つに記載の方法。
〔３１５〕抗原結合分子がFc領域をさらに含む、〔３０１〕から〔３１４〕のいずれか１つに記載の方法。
〔３１６〕前記Fc領域が第1のFc領域サブユニットおよび第2のFc領域サブユニットを含み、
　第1のFc領域サブユニットが、以下：
234位および235位の各々にアラニンを含む、Fc領域ポリペプチド；
234位、235位、および297位の各々にアラニンを含む、Fc領域ポリペプチド；ならびに
234位、235位、および297位の各々にアラニン、354位にシステイン、および366位にトリプトファンを含む、Fc領域ポリペプチド
からなる群より選択され、かつ
　第2のFc領域サブユニットが、以下：
234位および235位の各々にアラニンを含む、Fc領域ポリペプチド；
234位、235位、および297位の各々にアラニンを含む、Fc領域ポリペプチド；ならびに
234位、235位、および297位の各々にアラニン、349位にシステイン、および366位にセリン、368位にアラニン、および407位にバリンを含む、Fc領域ポリペプチド
からなる群より選択され、
すべての位置がEUナンバリングによるものである、
〔３１５〕に記載の方法。
〔３１７〕Fc領域が、以下：
（a）配列番号：23に示されるアミノ酸配列を含む第1のFc領域サブユニットおよび配列番号：24に示されるアミノ酸配列を含む第2のFc領域サブユニット；
（b）配列番号：25に示されるアミノ酸配列を含む第1のFc領域サブユニットおよび配列番号：26に示されるアミノ酸配列を含む第2のFc領域サブユニット、または
（c）配列番号：58に示されるアミノ酸配列を含む第1のFc領域サブユニットおよび配列番号：59に示されるアミノ酸配列を含む第2のFc領域サブユニット
のいずれか１つを含む、〔３１６〕または〔３１７〕のいずれか１つに記載の方法。
〔３１８〕抗原結合分子が、
（a1）配列番号：39に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、
　　　配列番号：40に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、
　　　配列番号：41に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および
　　　配列番号：42に記載のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4および鎖5）；
（a2）配列番号：43に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、
　　　配列番号：40に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、
　　　配列番号：44に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および
　　　配列番号：42に記載のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4および鎖5）；ならびに
（a3）配列番号：45に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、
　　　配列番号：40に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、
　　　配列番号：44に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および
　　　配列番号：42に記載のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4および鎖5）；
からなる群より選択される組み合わせのいずれか1つにおける5本のポリペプチド鎖を含み、好ましくは、5本のポリペプチド鎖（鎖1～鎖5）が、図３に示される配向性に従って相互に連結および/または会合されるものである、〔３０１〕から〔３１７〕のいずれか１つに記載の方法。
〔３１９〕抗原結合分子が、配列番号：54に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：55に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：56に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：57に記載のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4および鎖5）の5本のポリペプチド鎖を含み、好ましくは、5本のポリペプチド鎖（鎖1～鎖5）が、図３に示される配向性に従って相互に連結および/または会合されるものである、〔３０１〕に記載の方法。
〔３２０〕抗原結合分子が、配列番号：54に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：55に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：60に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：57に記載のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4および鎖5）の5本のポリペプチド鎖を含み、好ましくは、5本のポリペプチド鎖（鎖1～鎖5）が、図３に示される配向性に従って相互に連結および/または会合されるものである、〔３０１〕に記載の方法。

　また本開示は、以下の発明に関する。
〔４０１〕前記調製物における、(i) ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間で形成される少なくとも１つのジスルフィド結合を有する抗原結合分子（ＬＩＮＣ体）、および(ii) 当該抗原結合分子のジスルフィド結合のミスマッチ体および／または形成不全体（ｕｎＬＩＮＣ体）の合計に対する、ヒンジ領域以外の領域に少なくとも１つのジスルフィド結合を有する抗原結合分子（ＬＩＮＣ体）の割合（ＬＩＮＣ率）を定量する工程をさらに含む、〔１〕から〔５２〕、〔Ａ１〕から〔Ａ２４〕、〔Ｂ１〕から〔Ｂ１５〕、〔１０１〕から〔１５０〕、〔２０１〕から〔２６５〕、〔３０１〕から〔３２０〕のいずれか１つに記載の方法。
〔４０２〕定量する工程が、電気泳動法、クロマトグラフィー法を含む、〔４０１〕に記載の方法。
〔４０３〕電気泳動法が、非還元SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（SDS-PAGE）、および非還元キャピラリーSDSゲル電気泳動法（CE-SDS）からなる群より選択される、〔４０２〕に記載の方法。
〔４０４〕クロマトグラフィー法が、疎水性相互作用クロマトグラフィー法(HICである、〔４０２〕に記載の方法。
〔４０５〕定量する工程の前に、調製物にプロテアーゼを添加する工程を含む、〔４０１〕から〔４０４〕のいずれか１つに記載の方法。
〔４０６〕プロテアーゼが、抗原結合分子のアミノ酸配列KSCDKT/HTCPPCPのTH間で抗原結合分子を消化するプロテアーゼである、〔４０５〕に記載の方法。
〔４０７〕抗原結合分子がヒトＩｇＧ１抗体である、〔４０６〕に記載の方法。
〔４０８〕プロテアーゼがIdgEである、〔４０６〕または〔４０７〕に記載の方法。
〔４０９〕IdgEがStreptococcus agalactiaeに由来する、〔４０８〕に記載の方法。
〔４１０〕定量する工程が、非還元キャピラリーSDSゲル電気泳動法（CE-SDS）または疎水性相互作用クロマトグラフィー法(HIC)を含む、〔４０５〕から〔４０９〕のいずれかに記載の方法。
〔４１１〕定量する工程が、非還元キャピラリーSDSゲル電気泳動法（CE-SDS）を含み、プロテアーゼが添加されていない調製物、およびプロテアーゼのみを含む試料について非還元キャピラリーSDSゲル電気泳動法（CE-SDS）を行う工程をさらに含む、〔４１０〕に記載の方法。
〔４１２〕プロテアーゼが添加された調製物、プロテアーゼが添加されていない調製物、およびプロテアーゼのみを含む試料についてelectropherogramを調製する工程をさらに含む、〔４１１〕に記載の方法。
〔４１３〕ＬＩＮＣ率が、（ｕｎＬＩＮＣ体由来のピークおよびプロテアーゼ由来のピークを含む、プロテアーゼが添加された調製物由来のピーク）－（ｕｎＬＩＮＣ体由来のピークを含まない、プロテアーゼが添加されていない調製物由来のピーク）－（プロテアーゼのみを含む試料由来のピーク）＋（ＬＩＮＣ体由来のピーク）に対する、（ＬＩＮＣ体由来のピーク）の割合によって求められる、〔４１２〕に記載の方法。
〔４１４〕定量する工程が、疎水性相互作用クロマトグラフィー法(HIC)を含み、ＬＩＮＣ率が、ＬＩＮＣ体に由来するピークと全てのｕｎＬＩＮＣ体に由来するピークの合計に対する、ＬＩＮＣ体に由来するピークの割合によって求められる、〔４１０〕に記載の方法。
〔４１５〕〔１〕から〔５２〕、〔Ｂ１〕から〔Ｂ１５〕、〔１０１〕から〔１５０〕、〔２０１〕から〔２６５〕、〔３０１〕から〔３２０〕におけるクロマトグラフィーが膜クロマトグラフィーである、〔４０５〕から〔４１４〕のいずれか１つに記載の方法。
〔４１６〕プロテアーゼを添加した後、調製物を培養する工程をさらに含む、〔４０５〕から〔４１５〕のいずれか１つに記載の方法。

　また本開示は、以下の発明に関する。
〔５０１〕〔１〕から〔５２〕、〔Ａ１〕から〔Ａ２４〕、〔Ｂ１〕から〔Ｂ１５〕、〔１０１〕から〔１５０〕、〔２０１〕から〔２６５〕、〔３０１〕から〔３２０〕、および〔４０１〕から〔４１６〕のいずれか１つに記載の方法により製造された、ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間で形成される少なくとも１つのジスルフィド結合を有する抗原結合分子を含む調製物。
〔５０２〕〔１〕から〔５２〕、〔Ａ１〕から〔Ａ２４〕、〔Ｂ１〕から〔Ｂ１５〕、〔１０１〕から〔１５０〕、〔２０１〕から〔２６５〕、〔３０１〕から〔３２０〕、および〔４０１〕から〔４１６〕のいずれか１つに記載の方法により製造された、ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間で形成される少なくとも１つのジスルフィド結合を有する抗原結合分子を含む調製物を含む、医薬組成物。

　本開示において、ヒンジ領域以外の領域に適切なジスルフィド結合を有する抗原結合分子の効率的かつ容易な製造方法および精製方法が提供された。本開示における方法により、簡便かつ迅速・高収率にLINC-Igフォーマットを取得することが可能である。本開示における方法は、還元剤の種類、濃度、pH、反応時間などに関して、幅広い範囲で適応可能であるという利点を有する。

　また本開示における方法のようなカラム内におけるLINC-Igフォーマットの製造および精製は、タンク内におけるそれらと比較して、抗原結合分子の凝集を抑制できる、反応時間が短い、操作性が容易、プログラム化されたLC（液体クロマトグラフィー）により自動化が可能、反応中の還元剤の濃度を一定に保つことが可能、スケール間で再現しやすいなどの利点を有する。

Cysにより還元されたサンプルの分析結果を示す図である。左から、還元/酸化工程をスキップしてアフィニティクロマトグラフィーを実施したCtrl(1サンプル)、0.1-100 mmol/L Cys溶液pH 7.0(4サンプル)、0.1-100 mmol/L Cys溶液pH 8.0(4サンプル)を示す。pH 7.0、8.0共に、特に0.1-10 mmol/Lの濃度域で効果的にLINC率を向上させることが確認された。100 mmol/Lの結果はゲル上でバンドを確認できず、正確なLINC率を算出できないため「-」と表記している。 TCEPにより還元されたサンプルの分析結果を示す図である。左から、還元/酸化工程をスキップしてアフィニティクロマトグラフィーを実施したCtrl(1サンプル)、0.001-1 mmol/L TCEP溶液pH 7.0(4サンプル)、0.001-1 mmol/L TCEP溶液pH 8.0(4サンプル)を示す。0.1-1 mmol/Lの結果はゲル上でバンドを確認できず、正確なLINC率を算出できないため「-」と表記している。 DUAL/LINC（1＋2）フォーマットでの三価抗体の設計および命名規則を示す図である。 CE-SDSによる、electropherogramを示す図である。 HIS分析による、ピーク名を含むchromatogramの示す図である。標準chromatogram(上図)と拡大chromatogram(下図)を示す。

態様の説明
　本明細書において記載または参照される技法および手順は、概して十分に理解されており、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.；Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., (2003))；the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)：PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995))、Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual、およびAnimal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987))；Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984)；Methods in Molecular Biology, Humana Press；Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press；Animal Cell Culture (R.I. Freshney), ed., 1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press；Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons；Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987)；PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994)；Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991)；Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)；Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997)；Antibodies (P. Finch, 1997)；Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989)；Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)；Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)；The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)；ならびにCancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993) に記載される広く利用されている方法論などの従来の方法論を使用して当業者によって一般的に用いられるものである。

　以下の定義および詳細な説明は、本明細書において説明する本開示の理解を容易にするために提供される。

Ｉ．定義
　本明細書において、アミノ酸改変の部位を記載する際の用語「および／または」の意味は、「および」と「または」が適切に組み合わされたあらゆる組み合わせを含む。具体的には、例えば、「33位、55位、および／または96位のアミノ酸が置換されている」は、アミノ酸改変の以下のバリエーションを含む：(a) 33位、(b) 55位、(c) 96位、(d) 33位および55位、(e) 33位および96位、(f) 55位および96位、ならびに (g) 33位、55位、および96位のアミノ酸。

　別段示さない限り、軽鎖定常領域中のアミノ酸残基は、本明細書ではKabatらに従ってナンバリングされ、重鎖定常領域中のアミノ酸残基のナンバリングは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されているような、EUインデックスとも呼ばれる、EUナンバリングシステムに従う。

アミノ酸
　本明細書において、アミノ酸は、1文字コードもしくは3文字コードまたはその両方、例えば、Ala/A、Leu/L、Arg/R、Lys/K、Asn/N、Met/M、Asp/D、Phe/F、Cys/C、Pro/P、Gln/Q、Ser/S、Glu/E、Thr/T、Gly/G、Trp/W、His/H、Tyr/Y、Ile/I、またはVal/Vによって記載される。

アミノ酸の改変
　抗原結合分子のアミノ酸配列中のアミノ酸改変（本明細書において「アミノ酸置換」または「アミノ酸変異」とも記載される）のためには、部位特異的変異誘発法（Kunkelら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492））および重複伸長PCRなどの公知の方法が適宜採用され得る。さらに、非天然アミノ酸に置換するためのアミノ酸改変方法として、いくつかの公知の方法もまた採用され得る（Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249；およびProc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357）。例えば、終止コドンの1つであるUAGコドン（アンバーコドン）の相補的アンバーサプレッサーtRNAに非天然アミノ酸が結合したtRNAを含む無細胞翻訳系 (Clover Direct (Protein Express)) を用いることが適切である。

　さらに、本明細書において、アミノ酸の改変を示す表現として、特定の位置を表す数字の前および後に、それぞれ改変前および改変後のアミノ酸の1文字コードまたは3文字コードを示す表現が、適宜使用され得る。例えば、抗体可変領域中に含まれるアミノ酸を置換する際に用いられるN100bLまたはAsn100bLeuという改変は、100b位（Kabatナンバリングによる）におけるAsnの、Leuによる置換を表す。すなわち、数字はKabatナンバリングによるアミノ酸の位置を示し、数字の前に記載される1文字または3文字のアミノ酸コードは置換前のアミノ酸を示し、数字の後に記載される1文字または3文字のアミノ酸コードは置換後のアミノ酸を示す。同様に、抗体定常領域中に含まれるFc領域のアミノ酸を置換する際に用いられるP238DまたはPro238Aspという改変は、238位（EUナンバリングによる）におけるProの、Aspによる置換を表す。すなわち、数字はEUナンバリングによるアミノ酸の位置を示し、数字の前に記載される1文字または3文字のアミノ酸コードは置換前のアミノ酸を示し、数字の後に記載される1文字または3文字のアミノ酸コードは置換後のアミノ酸を示す。

ポリペプチド
　本明細書で用いられる用語「ポリペプチド」は、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）によって直鎖状に連結された単量体（アミノ酸）で構成される分子を指す。用語「ポリペプチド」は、2アミノ酸以上の任意の鎖を指し、特定の長さの産物を指すものではない。よって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または2アミノ酸以上の鎖を指すために用いられる任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義内に含まれ、用語「ポリペプチド」は、これらの用語のいずれかの代わりにまたは相互に交換可能に用いられてもよい。用語「ポリペプチド」はまた、限定されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基/ブロッキング基による誘導体化、タンパク質切断、または非天然アミノ酸による修飾を含む、ポリペプチドの発現後修飾の産物を指すことも意図する。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源に由来してもよく、または組換え技術によって産生されてもよいが、必ずしも指定の核酸から翻訳される必要はない。それは、化学合成を含む、任意の方法で生成されてもよい。本明細書において記載されるポリペプチドは、約3アミノ酸以上、5アミノ酸以上、10アミノ酸以上、20アミノ酸以上、25アミノ酸以上、50アミノ酸以上、75アミノ酸以上、100アミノ酸以上、200アミノ酸以上、500アミノ酸以上、1,000アミノ酸以上、または2,000アミノ酸以上のサイズのものであってもよい。ポリペプチドは規定された三次元構造を有し得るが、それらは必ずしもそのような構造を有する必要はない。規定された三次元構造を有するポリペプチドは、折り畳まれたと称され、規定された三次元構造をもたないが多数の異なる立体構造をとり得るポリペプチドは、折り畳まれていないと称される。

パーセント (％) アミノ酸配列同一性
　参照ポリペプチド配列に対する「パーセント (％) アミノ酸配列同一性」は、最大のパーセント配列同一性を得るように配列を整列させてかつ必要ならギャップを導入した後の、かつ、いかなる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした時の、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の、百分率比として定義される。％アミノ酸配列同一性を決める目的のアラインメントは、当該技術分野における技術の範囲内にある種々の方法、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN、またはMegalign (DNASTAR) ソフトウェアなどの、公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することにより達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列のアラインメントをとるための適切なパラメーターを決定することができる。しかしながら、本明細書における目的のために、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムであるALIGN-2を使用して生成される。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムは、ジェネンテック社の著作であり、そのソースコードは米国著作権庁 (U.S. Copyright Office, Wasington D.C., 20559) に使用者用書類と共に提出され、米国著作権登録番号TXU510087として登録されている。ALIGN-2プログラムは、ジェネンテック社 (Genentech, Inc., South San Francisco, California) から公に入手可能であるし、ソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN-2プログラムは、Digital UNIX V4.0Dを含むUNIXオペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされる。すべての配列比較パラメーターは、ALIGN-2プログラムによって設定され、変動しない。アミノ酸配列比較にALIGN-2が用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Aの、所与のアミノ酸配列Bへの、またはそれとの、またはそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、所与のアミノ酸配列Bへの、またはそれとの、またはそれに対する、ある％アミノ酸配列同一性を有するまたは含む所与のアミノ酸配列A、ということもできる）は、次のように計算される：
分率X／Yの100倍
ここで、Xは配列アラインメントプログラムALIGN-2によって、当該プログラムのAおよびBのアラインメントにおいて同一である一致としてスコアされたアミノ酸残基の数であり、YはB中のアミノ酸残基の全数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと等しくない場合、AのBへの％アミノ酸配列同一性は、BのAへの％アミノ酸配列同一性と等しくないことが、理解されるであろう。別段特に明示しない限り、本明細書で用いられるすべての％アミノ酸配列同一性値は、直前の段落で述べたとおりALIGN-2コンピュータプログラムを用いて得られるものである。

抗原結合分子
　本明細書で用いられる用語「抗原結合分子」は、その最も広い意味において、抗原決定基（エピトープ）に特異的に結合する分子であって、抗原結合ドメインを含む任意の分子、または抗原に対する結合活性を有する任意の分子を指し、約5アミノ酸以上の長さを有するペプチドまたはタンパク質などの分子をさらに指し得る。ペプチドおよびタンパク質は、生物に由来するものに限定されず、例えば、それらは、人工的に設計された配列から産生されたポリペプチドであってもよい。それらは、天然ポリペプチド、合成ポリペプチド、組換えポリペプチド等のいずれかであってもよい。スキャフォールドとしてα/βバレルなどの公知の安定な立体構造を含み、分子の一部が抗原結合ドメインになる、スキャフォールド分子もまた、本明細書において記載される抗原結合分子の一態様である。一態様において、抗原結合分子は２以上（例えば、２、３、４、５、またはそれ以上）のポリペプチド鎖を含み得る。一態様において、抗原結合分子を構成するポリペプチド鎖は抗体重鎖または抗体軽鎖であってもよい。すなわち、一態様において、抗原結合分子は、抗体、抗体断片、または抗体誘導体である。一態様において、抗原結合分子は、本願の図3に示されるような鎖1～鎖5を含む3価抗体である。一態様において、抗原結合分子は、非抗体タンパク質、またはその断片、もしくはその誘導体である。

多重特異性抗原結合分子
　「多重特異性抗原結合分子」は、2つ以上の抗原に特異的に結合する抗原結合分子を指す。用語「二重特異性」は、抗原結合分子が、少なくとも2種類の異なる抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。用語「三重特異性」は、抗原結合分子が少なくとも3種類の異なる抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。
　特定の態様において、本出願の多重特異性抗原結合分子は、CD3またはCD137のいずれか一方に結合することができるが、両方の抗原に同時には結合せず、かつDLL3に特異的に結合することができる、三重特異性抗原結合分子である。

抗原結合ドメイン
　本明細書において「抗原結合ドメイン」とは、抗原の一部または全部に特異的に結合しかつ相補的である領域をいう。本明細書において、抗原結合分子は抗原結合ドメインを含む。抗原の分子量が大きい場合、抗原結合ドメインは抗原の特定部分にのみ結合することができる。当該特定部分はエピトープと呼ばれる。一態様において、抗原結合ドメインは特定の抗原に結合する抗体断片を含む。抗原結合ドメインは一つまたは複数の抗体可変ドメインより提供され得る。非限定的な一態様において、抗原結合ドメインは抗体軽鎖可変領域（VL）と抗体重鎖可変領域（VH）とを含む。こうした抗原結合ドメインの例としては、「scFv（single chain Fv）」、「単鎖抗体（single chain antibody）」、「Fv」、「scFv2（single chain Fv 2）」、「Fab」、および「Fab'」等が挙げられる。別の態様において、抗原結合ドメインは特定の抗原に結合する非抗体タンパク質またはその断片を含む。特定の態様において、抗原結合ドメインは、ＣＨ１領域を含むＦａｂの１つまたは２つを含む。特定の態様において、抗原結合ドメインはヒンジ領域を含む。

　本明細書で用いられる用語「抗原結合ドメイン」は、それが結合している実体を、標的部位、例えばがん抗原（DLL3）を発現する特定の種類の腫瘍細胞へと方向付けることができる。抗原結合ドメインは、その標的抗原、例えばT細胞受容体複合体抗原（特に、CD3）および/または共刺激受容体（CD137）を通じてシグナル伝達を活性化することができる。

　抗原結合ドメイン等に関して、本明細書で用いられる用語「第一の」、「第二の」、および「第三の」は、2種類以上の種類別の部分等が存在する場合に区別するという利便性のために用いられる。これらの用語の使用は、別段明示しない限り、抗原結合分子の特定の順序または向きを付与することを意図しない。

　本明細書において「特異的に結合する」とは、特異的結合に関与する分子の一方の分子がその一つまたは複数の結合パートナー分子以外の分子に対しては何ら有意な結合を示さない状態で結合することを意味する。また、この表現は、抗原結合ドメインが、ある抗原中に含まれる複数のエピトープのうち特定のエピトープに対して特異的である場合にも用いられる。抗原結合ドメインが結合するエピトープが複数の異なる抗原に含まれる場合、当該抗原結合ドメインを含む抗原結合分子は当該エピトープを含む様々な抗原と結合することができる。

　本開示において、「同じエピトープに結合する」とは、2つの抗原結合ドメインが結合するエピトープが少なくとも一部重複することを意味する。重複する程度は、限定されないが、少なくとも10％以上、好ましくは20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、特に好ましくは90％以上、最も好ましくは100％である。

抗体
　本明細書で用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、所望の抗原結合活性を示す限りは、これらに限定されるものではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体または三重特異性抗体）および抗体断片を含む、種々の抗体構造を包含する。

　用語「免疫グロブリン分子」は、天然に存在する抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、IgGクラスの免疫グロブリンは、ジスルフィド結合で結合された2つの軽鎖および2つの重鎖で構成された、約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各重鎖は、N末端からC末端へ、可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（VH）と、その後に続く重鎖定常領域とも呼ばれる3種類の定常ドメイン（CH1、CH2、およびCH3）とを有する。同様に、各軽鎖は、N末端からC末端へ、可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（VL）と、その後に続く軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽鎖（CL）ドメインとを有する。免疫グロブリンの重鎖は、α（IgA）、δ（IgD）、ε（IgE）、γ（IgG）、またはμ（IgM）と呼ばれる5つのタイプのうちの1つに割り当てられてもよく、それらの一部は、サブタイプ、例えば、γ1（IgG1）、γ2（IgG2）、γ3（IgG3）、γ4（IgG4）、α1（IgA1）、およびα2（IgA2）にさらに分類されてもよい。免疫グロブリンの軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパおよびラムダと呼ばれる2つのタイプのうちの1つに割り当てられもよい。免疫グロブリンは、免疫グロブリンヒンジ領域を介して連結された、2つのFab分子およびFcドメインから本質的になる。

　本明細書でいう用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体のことをいう。すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、生じ得るバリアント抗体（例えば、自然に生じる変異を含むバリアント抗体、またはモノクローナル抗体調製物の製造中に発生するバリアント抗体。そのようなバリアントは通常若干量存在している。）を除いて、同一でありおよび／または同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。したがって、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られるものである、という抗体の特徴を示し、何らかの特定の方法による抗体の製造を求めるものと解釈されるべきではない。例えばモノクローナル抗体は、これらに限定されるものではないが、ハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージディスプレイ法、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含んだトランスジェニック動物を利用する方法を含む、様々な手法によって作成されてよく、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法および他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。

　用語「全長抗体」、「完全抗体」、および「全部抗体」は、本明細書では相互に交換可能に用いられ、天然型抗体構造に実質的に類似した構造を有する、または本明細書で定義するFc領域を含む重鎖を有する抗体のことをいう。

　抗体の「クラス」は、抗体の重鎖に備わる定常ドメインまたは定常領域のタイプのことをいう。抗体には5つの主要なクラスがある：IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMである。そして、このうちいくつかはさらにサブクラス（アイソタイプ）に分けられてもよい。例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2である。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインを、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ぶ。

　用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体を抗原へと結合させることに関与する、抗体の重鎖または軽鎖のドメインのことをいう。天然型抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれVHおよびVL）は、通常、各ドメインが4つの保存されたフレームワーク領域 (FR) および3つの超可変領域 (HVR) を含む、類似の構造を有する（例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007) 参照）。1つのVHまたはVLドメインで、抗原結合特異性を与えるに充分であろう。さらに、ある特定の抗原に結合する抗体は、当該抗原に結合する抗体からのVHまたはVLドメインを使ってそれぞれVLまたはVHドメインの相補的ライブラリをスクリーニングして、単離されてもよい。例えばPortolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993)； Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991) 参照。

　本明細書で用いられる用語「超可変領域」または「HVR」は、配列において超可変であり（「相補性決定領域」または「CDR」(complementarity determining region)）、および／または構造的に定まったループ（「超可変ループ」）を形成し、および／または抗原接触残基（「抗原接触」）を含む、抗体の可変ドメインの各領域のことをいう。通常、抗体は6つのHVRを含む：VHに3つ（H1、H2、H3）、およびVLに3つ（L1、L2、L3）である。本明細書での例示的なHVRは、以下のものを含む：
　(a) アミノ酸残基26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)、および96-101 (H3)のところで生じる超可変ループ (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))；
　(b) アミノ酸残基24-34 (L1)、50-56 (L2)、89-97 (L3)、31-35b (H1)、50-65 (H2)、および95-102 (H3)のところで生じるCDR (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))；
　(c) アミノ酸残基27c-36 (L1)、46-55 (L2)、89-96 (L3)、30-35b (H1)、47-58 (H2)、および93-101 (H3) のところで生じる抗原接触 (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996))；ならびに、
　(d) HVRアミノ酸残基46-56 (L2)、47-56 (L2)、48-56 (L2)、49-56 (L2)、26-35 (H1)、26-35b (H1)、49-65 (H2)、93-102 (H3)、および94-102 (H3)を含む、(a)、(b)、および／または(c)の組合せ。
　別段示さない限り、HVR残基および可変ドメイン中の他の残基（例えば、FR残基）は、本明細書では上記のKabatらにしたがって番号付けされる。
　HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3は、それぞれ、「H-CDR1」、「H-CDR2」、「H-CDR3」、「L-CDR1」、「L-CDR2」、および「L-CDR3」とも記載される。

　「フレームワーク」または「FR」は、超可変領域 (HVR) 残基以外の、可変ドメイン残基のことをいう。可変ドメインのFRは、通常4つのFRドメイン：FR1、FR2、FR3、およびFR4からなる。それに応じて、HVRおよびFRの配列は、通常次の順序でVH（またはVL）に現れる：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。

　「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンVLまたはVHフレームワーク配列の選択群において最も共通して生じるアミノ酸残基を示すフレームワークである。通常、ヒト免疫グロブリンVLまたはVH配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからである。通常、配列のサブグループは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3におけるサブグループである。1つの態様において、VLについて、サブグループは上記のKabatらによるサブグループκIである。1つの態様において、VHについて、サブグループは上記のKabatらによるサブグループIIIである。

　「ヒンジ領域」という用語は、野生型抗体重鎖においてCH1ドメインおよびCH2ドメインを連結する、例えばEUナンバリングシステムによれば216位あたりから230位あたりまでの、またはKabatナンバリングシステムによれば226位あたりから243位あたりまでの、抗体重鎖ポリペプチド部分を意味する。天然型IgG抗体において、ヒンジ領域におけるEUナンバリング220位のシステイン残基は、抗体軽鎖における214位のシステイン残基とジスルフィド結合を形成することが知られている。さらに、2つの抗体重鎖の間では、ヒンジ領域におけるEUナンバリング226位のシステイン残基どうし、および229位のシステイン残基どうしがジスルフィド結合を形成することが知られている。一般に、「ヒンジ領域」は、ヒトIgG1の216位～238位（EUナンバリング）または226位～251位（Kabatナンバリング）に及ぶとして定義される。このヒンジは、3つの異なる領域、上部ヒンジ、中央ヒンジ、および下部ヒンジにさらに分けることができる。ヒトIgG1抗体では、これらの領域は概して、以下のように定義される：
　上部ヒンジ：216位～225位（EUナンバリング）または 226位～238位（Kabatナンバリング）、
　中央ヒンジ：226位～230位（EUナンバリング）または 239位～243位（Kabatナンバリング）、
　下部ヒンジ：231位～238位（EUナンバリング）または 244位～251位（Kabatナンバリング）。
　他のIgGアイソタイプのヒンジ領域は、重鎖間SS結合を形成する最初と最後のシステイン残基を同じ位置に配置することによって、IgG1配列と整列させることができる（例えば、Brekke et al., 1995, Immunol (Table 1 of Today 16: 85-90を参照)）。本明細書におけるヒンジ領域としては、野生型ヒンジ領域、ならびに野生型ヒンジ領域中のアミノ酸残基が置換、付加、または欠失によって変化しているバリアントが挙げられる。

　用語（アミノ酸残基が）「連結されることができる」および（ジスルフィド結合が）「形成されることができる」には、ジスルフィド結合が既に形成されている場合、およびジスルフィド結合が形成されていないが適切な条件下で後に形成され得る場合が含まれる。

　用語「ヒンジ領域内にはないアミノ酸間で形成されるジスルフィド結合」（または「ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間で形成されるジスルフィド結合」）は、上記で定義した「ヒンジ領域」以外のいずれかの抗体領域中に位置するアミノ酸を通じて形成される、接続される、または連結されるジスルフィド結合を意味する。例えば、そのようなジスルフィド結合は、抗体中の、ヒンジ領域（例えば、EUナンバリングシステムによる約216位～約230位、またはKabatナンバリングシステムによる約226位～約243位）以外の任意の位置にあるアミノ酸を通じて形成される、接続される、または連結される。いくつかの態様において、そのようなジスルフィド結合は、CH1領域、CL領域、VL領域、VH領域、および/またはVHH領域中に位置するアミノ酸を通じて形成される、接続される、または連結される。いくつかの態様において、そのようなジスルフィド結合は、CH1領域におけるEUナンバリング119位～123位、131位～140位、148位～150位、155位～167位、174位～178位、188位～197位、201位～214位に位置するアミノ酸を通じて形成される、接続される、または連結される。いくつかの態様において、そのようなジスルフィド結合は、CH1領域におけるEUナンバリング119位、122位、123位、131位、132位、133位、134位、135位、136位、137位、138位、139位、140位、148位、150位、155位、156位、157位、159位、160位、161位、162位、163位、164位、165位、167位、174位、176位、177位、178位、188位、189位、190位、191位、192位、193位、194位、195位、196位、197位、201位、203位、205位、206位、207位、208位、211位、212位、213位、214位に位置するアミノ酸を通じて形成される、接続される、または連結される。いくつかの態様において、そのようなジスルフィド結合は、CH1領域におけるEUナンバリング188位、189位、190位、191位、192位、193位、194位、195位、196位、および197位に位置するアミノ酸を通じて形成される、接続される、または連結される。1つの好ましい態様において、そのようなジスルフィド結合は、CH1領域におけるEUナンバリング191位に位置するアミノ酸を通じて形成される、接続される、または連結される。

　用語「ミスマッチ体」は、ジスルフィド結合が所望のものと異なるアミノ酸残基間で形成されている抗原結合分子を意味する。抗原結合分子が所望のアミノ酸残基間で形成されているジスルフィド結合と所望のものと異なるアミノ酸残基間で形成されているジスルフィド結合を含む場合、そのような抗原結合分子は、本明細書におけるミスマッチ体に含まれる。

　用語「形成不全体」はシステイン残基がフリーの状態で残存している抗原結合分子や、システイン残基が抗原結合分子を形成する分子とは異なる分子（例えば不純物分子等）とジスルフィド結合を形成しているものをいう。本明細書における「形成不全体」はこのような特徴を有すればよく、例えば、ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間で形成されるジスルフィド結合（所望のジスルフィド結合）や、所望のジスルフィド結合とは異なるジスルフィド結合（ミスマッチ部分）も含むものであっても、上記特徴を有する限り、本明細書における「形成不全体」に含まれる。

　定常領域は、好ましくは抗体定常領域であり、より好ましくはIgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4型の抗体定常領域であり、さらにより好ましくはヒトIgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4型の抗体定常領域である。また定常領域は、好ましくは重鎖定常領域であり、より好ましくはIgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4型の重鎖定常領域であり、さらにより好ましくはヒトIgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4型の重鎖定常領域である。ヒトIgG1定常領域、ヒトIgG2定常領域、ヒトIgG3定常領域、およびヒトIgG4定常領域のアミノ酸配列は公知である。ヒトIgG1、ヒトIgG2、ヒトIgG3、およびヒトIgG4の定常領域としては、遺伝子多型による複数のアロタイプ配列がSequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242に記載されており、そのいずれも本発明において使用することができる。アミノ酸が改変された定常領域は、本発明のアミノ酸変異を含むものである限り、他のアミノ酸変異や修飾を含んでもよい。

　本明細書において、用語「Fc領域」または「Fcドメイン」は、抗体分子中の、ヒンジまたはその一部、ならびにCH2およびCH3ドメインからなる断片を含む領域を指す。IgGクラスのFc領域は、例えば、システイン226（EU ナンバリング（本明細書においてEUインデックスとも称される））からC末端まで、またはプロリン230（EUナンバリング）からC末端までの領域を意味するが、それに限定されない。Fc領域は、好ましくは、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4モノクローナル抗体を、ペプシンなどのタンパク質分解酵素で部分消化した後に、プロテインAカラムまたはプロテインGカラムに吸着された画分を再溶出することによって取得することができる。そのようなタンパク質分解酵素は、適宜設定される酵素の反応条件（例えば、pH）の下で制限的にFabまたはF(ab')₂を形成するように全長抗体を消化することができる限り、特に限定されない。その例には、ペプシンおよびパパインが含まれ得る。

　例えば、天然型IgGに由来するFc領域を「Fc領域」として用いることができる。ここで、天然型IgGとは、天然に見出されるIgGと同一のアミノ酸配列を含有し、免疫グロブリンγ遺伝子により実質的にコードされる抗体のクラスに属するポリペプチドを意味する。天然型ヒトIgGとは、例えば、天然型ヒトIgG1、天然型ヒトIgG2、天然型ヒトIgG3、または天然型ヒトIgG4を意味する。天然型IgGにはまた、自然発生的にそれに由来するバリアントなども含まれる。遺伝子多型に基づく複数のアロタイプ配列が、ヒトIgG1、ヒトIgG2、ヒトIgG3、およびヒトIgG4抗体の定常領域としてSequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242に記載されており、それらはいずれも、本発明において用いることができる。特に、ヒトIgG1の配列は、EUナンバリング356～358位のアミノ酸配列として、DELまたはEEMを有してもよい。

　抗原結合分子のFcドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含むポリペプチド鎖の対からなる。例えば、免疫グロブリンG（IgG）分子のFcドメインは、その各サブユニットがCH2およびCH3 IgG重鎖定常ドメインを含む、二量体である。Fcドメインの2つのサブユニットは、相互に安定的に会合することができる。1つの態様において、本明細書において記載される抗原結合分子は、1つ以下のFcドメインを含む。

　本明細書において、抗原結合分子のFcドメインはIgG Fcドメインである。特定の態様において、FcドメインはIgG1 Fcドメインである。別の態様において、FcドメインはIgG1 Fcドメインである。さらなる特定の態様において、FcドメインはヒトIgG1 Fc領域である。

キメラ抗体
　用語「キメラ」抗体は、重鎖および／または軽鎖の一部分が特定の供給源または種に由来する一方で、重鎖および／または軽鎖の残りの部分が異なった供給源または種に由来する抗体を指す。同様に、用語「キメラ抗体可変ドメイン」は、重鎖および／または軽鎖可変領域の一部分が特定の供給源または種に由来する一方で、重鎖および／または軽鎖可変領域の残りの部分が異なった供給源または種に由来する抗体可変領域を指す。

ヒト化抗体
　「ヒト化」抗体は、非ヒトHVRからのアミノ酸残基およびヒトFRからのアミノ酸残基を含む、キメラ抗体を指す。ある態様では、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、当該可変領域においては、すべてのもしくは実質的にすべてのHVR（例えばCDR）は非ヒト抗体のものに対応し、かつ、すべてのもしくは実質的にすべてのFRはヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含んでもよい。抗体（例えば、非ヒト抗体）の「ヒト化された形態」は、ヒト化を経た抗体を指す。「ヒト化抗体可変領域」は、ヒト化抗体の可変領域を指す。

抗体断片
　「抗体断片」は、完全抗体が結合する抗原に結合する当該完全抗体の一部分を含む、当該完全抗体以外の分子を指す。抗体断片の例は、これらに限定されるものではないが、Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2、ダイアボディ、線状抗体、単鎖抗体分子（例えば、scFv）、およびシングルドメイン抗体を含む。特定の抗体断片についての総説として、Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003) を参照のこと。scFv断片の総説として、例えば、Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994)；加えて、WO93/16185；ならびに米国特許第5,571,894号および第5,587,458号を参照のこと。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含みin vivoにおける半減期の長くなったFabおよびF(ab')₂断片についての論説として、米国特許第5,869,046号を参照のこと。ダイアボディは、二価または二重特異的であってよい、抗原結合部位を2つ伴う抗体断片である。例えば、EP404,097; WO1993/01161; Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003); Hollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993) 参照。トリアボディ (triabody) やテトラボディ (tetrabody) も、Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003) に記載されている。シングルドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインのすべてもしくは一部分、または軽鎖可変ドメインのすべてもしくは一部分を含む、抗体断片である。特定の態様において、シングルドメイン抗体は、ヒトシングルドメイン抗体である（Domantis, Inc., Waltham, MA；例えば、米国特許第6,248,516号B1参照）。抗体断片は、これらに限定されるものではないが、本明細書に記載の、完全抗体のタンパク質分解的消化、組換え宿主細胞（例えば、大腸菌またはファージ）による産生を含む、種々の手法により作ることができる。

Fv（variable fragment）
　本明細書において、「Fv（variable fragment）」という用語は、抗体の軽鎖可変領域（VL（light chain variable region））と抗体の重鎖可変領域（VH（heavy chain variable region））とのペアから構成されている抗体由来の抗原結合ドメインの最小単位を意味する。1988年にSkerraとPluckthunは、バクテリアのシグナル配列の下流に抗体の遺伝子を挿入し大腸菌中で当該遺伝子の発現を誘導することによって、均一でかつ活性を保持した抗体が大腸菌のペリプラズム画分から調製されることを見出した（Science (1988) 240 (4855), 1038-1041）。ペリプラズム画分から調製されたFvは、抗原に対する結合を有する態様でVHとVLが会合していた。

scFv、単鎖抗体、およびsc(Fv)2
　本明細書において、「scFv」、「単鎖抗体」、または「sc(Fv)2」という用語はすべて、単一のポリペプチド鎖内に、重鎖および軽鎖の両方に由来する可変領域を含むが、定常領域を欠いている抗体断片を意味する。一般に、単鎖抗体は、抗原結合を可能にすると思われる所望の構造を形成するのを可能にする、VHドメインとVLドメインの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。単鎖抗体は、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 113巻, Rosenburg、および、Moore編, Springer-Verlag, New York, 269～315（1994）においてPluckthunによって詳細に考察されている。同様に、国際特許出願公開WO 1988/001649; 米国特許第4,946,778号および同第5,260,203号を参照。特定の態様において、単鎖抗体は二重特異性であり、かつ／またはヒト化され得る。

　scFvはFvを構成するVHとVLとがペプチドリンカーによって連結された抗原結合ドメインである（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85 (16), 5879-5883）。当該ペプチドリンカーによってVHとVLとが近接した状態に保持され得る。

　sc(Fv)2は2つのVLと2つのVHの4つの可変領域がペプチドリンカー等のリンカーによって連結され一本鎖を構成する単鎖抗体である（J Immunol. Methods (1999) 231 (1-2), 177-189）。この2つのVHとVLは異なるモノクローナル抗体から由来することもあり得る。このようなsc(Fv)2は好ましくは、例えば、Journal of Immunology (1994) 152 (11), 5368-5374に開示されるような同一抗原中に存在する二種類のエピトープを認識する二重特異性sc(Fv)2を含む。sc(Fv)2は、当業者に公知の方法によって作製され得る。例えば、sc(Fv)2は、scFvをペプチドリンカー等のリンカーで連結することによって作製され得る。

　本明細書におけるsc(Fv)2を構成する抗原結合ドメインの形態としては、2つのVH単位および2つのVL単位が、一本鎖ポリペプチドのN末端を起点としてVH、VL、VH、VL（［VH］-リンカー-［VL］-リンカー-［VH］-リンカー-［VL］）の順に並んでいることを特徴とする抗体が挙げられるが、2つのVH単位と2つのVL単位の順序は特に上記の構成に限定されず、どのような順序で並べられていてもよい。例えば以下のような、順序の構成も挙げることができる。
［VL］-リンカー-［VH］-リンカー-［VH］-リンカー-［VL］
［VH］-リンカー-［VL］-リンカー-［VL］-リンカー-［VH］
［VH］-リンカー-［VH］-リンカー-［VL］-リンカー-［VL］
［VL］-リンカー-［VL］-リンカー-［VH］-リンカー-［VH］
［VL］-リンカー-［VH］-リンカー-［VL］-リンカー-［VH］

　sc(Fv)₂の分子形態についてはWO2006/132352においても詳細に記載されている。当業者であればこれらの記載に従って、本明細書で開示されるポリペプチド複合体を製造するために所望のsc(Fv)₂を適宜調製することが可能である。

　さらに本開示における抗原結合分子または抗体に、PEG等の担体高分子や抗がん剤等の有機化合物をコンジュゲートしてもよい。あるいは、糖鎖が所望の効果をもたらすように、糖鎖付加配列が抗原結合分子または抗体に好適に挿入される。

　抗体の可変領域の連結に使用するリンカーは、遺伝子工学により導入され得る任意のペプチドリンカー、合成リンカー、および例えばProtein Engineering, 9 (3), 299-305, 1996に開示されるリンカーを含む。しかしながら、本開示においてはペプチドリンカーが好ましい。ペプチドリンカーの長さは特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択することが可能である。長さは、好ましくは5アミノ酸以上（特に限定されないが、上限は通常、30アミノ酸以下、好ましくは20アミノ酸以下）であり、特に好ましくは15アミノ酸である。sc(Fv)₂に3つのペプチドリンカーが含まれる場合には、それらの長さはすべて同じであってもよいし異なってもよい。

　例えば、そのようなペプチドリンカーには以下のものが含まれる：
Ser、
Gly-Ser、
Gly-Gly-Ser、
Ser-Gly-Gly、
Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号：5）、
Ser-Gly-Gly-Gly（配列番号：6）、
Gly-Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号：7）、
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly（配列番号：8）、
Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号：9）、
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly（配列番号：10）、
Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号：11）、
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly（配列番号：12）、
(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号：7）)n、および
(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly（配列番号：8）)n。
ここでnは1以上の整数である。ペプチドリンカーの長さや配列は目的に応じて当業者が適宜選択することができる。

　合成リンカー（化学架橋剤）は、ペプチドの架橋に通常用いられており、例としては、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）、ジスクシンイミジルスベレート（DSS）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（BS3）、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（DSP）、ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（DTSSP）、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（EGS）、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）（スルホ－EGS）、ジスクシンイミジル酒石酸塩（DST）、ジスルホスクシンイミジル酒石酸塩（スルホ－DST）、ビス［2-（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（BSOCOES）、およびビス［2-（スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（スルホ-BSOCOES）が挙げられる。これらの架橋剤は市販されている。

　4つの抗体可変領域を連結するには、通常、3つのリンカーが必要となる。用いられるリンカーは、同じ種類のものであっても異なる種類のものであってもよい。

Fab、F(ab’)2、およびFab’
　「Fab分子」は、免疫グロブリンの重鎖のVHおよびCH1ドメイン（「Fab重鎖」）ならびに軽鎖のVLおよびCLドメイン（「Fab軽鎖」）からなるタンパク質を指す。野生型のFab分子の重鎖は、別の重鎖分子とのジスルフィド結合を形成できない。本明細書では野生型のFab分子のほか、野生型Fabにおけるアミノ酸残基が置換、付加、または欠失により変更されたFabバリアントも包含する。特定の態様において、Fabバリアントに含まれる変異アミノ酸残基（例えば、置換、付加、または挿入されたシステイン残基やリジン残基）は、別の重鎖分子またはその一部（例えばFab分子）とジスルフィド結合を形成できる。

　scFabはFabを構成する一本の軽鎖と一本の重鎖のCH1領域および可変領域とがペプチドリンカーによって連結された抗原結合ドメインである。当該ペプチドリンカーによって軽鎖と重鎖のCH1領域および可変領域とが近接した状態に保持され得る。

　「F(ab’)2」および「Fab’」とは、イムノグロブリン（モノクローナル抗体）をプロテアーゼであるペプシンおよびパパイン等で処理することにより作製され、イムノグロブリン（モノクローナル抗体）を2本のH鎖のヒンジ領域間に存在するジスルフィド結合の近くで消化して生成される抗体断片を意味する。例えば、パパインは、2本のH鎖のヒンジ領域間に存在するジスルフィド結合の上流でIgGを切断し、VL（L鎖可変領域）およびCL（L鎖定常領域）を含むL鎖が、VH（H鎖可変領域）およびCHγ1（H鎖定常領域中のγ1領域）を含むH鎖断片に、C末端領域でジスルフィド結合により結合した、相同な2つの抗体断片が製造され得る。これら2つの相同な抗体断片はそれぞれFab'と呼ばれる。

　「F(ab’)2」は、二本の軽鎖、ならびに、ジスルフィド結合が2つの重鎖間で形成されるようにCH1ドメインおよびCH2ドメインの一部分の定常領域を含む二本の重鎖から構成される。本明細書において開示されるF(ab’)2は、所望の抗原結合ドメインを有する全長モノクローナル抗体等をペプシン等のプロテアーゼにて部分消化した後に、Fc断片をプロテインAカラムに吸着させて除去することにより、好適に作製され得る。かかるプロテアーゼとしては、pH等の酵素の反応条件を適切に設定することにより制限的にF(ab’)2を生じるように全長抗体を切断し得るものであれば特段の限定はされず、このようなプロテアーゼには、例えば、ペプシンやフィシン等が含まれる。

融合される
　「融合される」は、構成成分（例えば、Fab分子およびFcドメインサブユニット）が、直接的に、または1つもしくは複数のペプチドリンカーを介して、ペプチド結合によって連結されることを意味する。

「クロスオーバー」Fab
　「クロスオーバー」Fab分子（「Crossfab」とも呼ばれる）は、Fab重鎖およびFab軽鎖の可変領域または定常領域のいずれかが交換されている、Fab分子を意味し、すなわち、クロスオーバーFab分子は、軽鎖可変領域および重鎖定常領域で構成されたペプチド鎖と、重鎖可変領域および軽鎖定常領域で構成されたペプチド鎖とを含む。明確にするために記すと、Fab軽鎖およびFab重鎖の可変領域が交換されているクロスオーバーFab分子では、重鎖定常領域を含むペプチド鎖が、本明細書において、クロスオーバーFab分子の「重鎖」と称される。反対に、Fab軽鎖およびFab重鎖の定常領域が交換されているクロスオーバーFab分子では、重鎖可変領域を含むペプチド鎖が、本明細書において、クロスオーバーFab分子の「重鎖」と称される。

「従来の」Fab
　それに対して、「従来の」Fab分子は、その天然のフォーマットでのFab分子、すなわち、重鎖の可変領域および定常領域で構成された重鎖（VH-CH1）、ならびに軽鎖の可変領域および定常領域で構成された軽鎖（VL-CL）を含むFab分子を意味する。

シングルドメイン抗体
　本明細書で「シングルドメイン抗体」という用語により言及されるものは、そのドメイン単独で抗原結合活性を発揮できるかぎり、その構造は特に限定されない。IgG抗体等で例示される通常の抗体は、VHとVLのペアリングにより可変領域を形成された状態では抗原結合活性を示すのに対し、シングルドメイン抗体は、他のドメインとペアリングすることなくシングルドメイン抗体自身のドメイン構造単独で抗原結合活性を発揮できることが知られている。シングルドメイン抗体は通常比較的に低い分子量を有し、単量体の形態で存在する。

　シングルドメイン抗体の例として、それだけに限定されないが、例えば、ラクダ科の動物のVHH、サメのV_NARのような天然に軽鎖を欠如する抗原結合分子、および抗体のVHドメインのすべてもしくは一部分またはVLドメインのすべてもしくは一部分を含む抗体断片が挙げられる。抗体のVH／VLドメインのすべてもしくは一部分を含む抗体断片であるシングルドメイン抗体の例として、それだけに限定されないが、例えば、米国特許第6,248,516号B1等に記載されているようなヒト抗体VHまたはヒト抗体VLから出発して人工的に作製されたシングルドメイン抗体が挙げられる。1つのシングルドメイン抗体は3つのCDR（CDR1、CDR2およびCDR3）を有する。

　シングルドメイン抗体は、シングルドメイン抗体を産生できる動物から、またはシングルドメイン抗体を産生できる動物を免疫することにより取得され得る。シングルドメイン抗体を産生できる動物の例として、それだけに限定されないが、例えば、ラクダ科動物、シングルドメイン抗体を産生できる遺伝子が導入された遺伝子導入動物（transgenic animals）が挙げられる。ラクダ科動物はラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダおよびグアナコ等を含む。シングルドメイン抗体を産生できる遺伝子が導入された遺伝子導入動物の例として、それだけに限定されないが、国際公開WO2015/143414号、米国特許公開US2011/0123527号A1に記載の遺伝子導入動物が挙げられる。動物から取得したシングルドメイン抗体のフレームワーク配列をヒト生殖系列配列またはそれに類似した配列に置き換えることで、ヒト化した単鎖抗体を取得することも出来る。ヒト化したシングルドメイン抗体（例えば、ヒト化VHH）は、シングルドメイン抗体の一実施態様である。

　また、シングルドメイン抗体は、シングルドメイン抗体を含むポリペプチドライブラリから、ELISA、パニング等により取得され得る。シングルドメイン抗体を含むポリペプチドライブラリの例として、それだけに限定されないが、例えば、各種動物またはヒトから取得したナイーブ抗体ライブラリ（例：Methods in Molecular Biology 2012 911 (65-78)、Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics 2006 1764:8 (1307-1319)）、各種動物を免疫することで取得した抗体ライブラリ（例：Journal of Applied Microbiology 2014 117:2 (528-536)）、および各種動物またはヒトの抗体遺伝子より作成した合成抗体ライブラリ（例：Journal of Biomolecular Screening 2016 21:1 (35-43)、Journal of Biological Chemistry 2016 291:24 (12641-12657)、AIDS 2016 30:11 (1691-1701)）が挙げられる。

　本明細書で用いられる「アゴニスト」抗原結合分子または「アゴニスト」抗体は、それが結合する抗原の生物学的活性を有意に増強する抗原結合分子または抗体である。

　本明細書で用いられる「阻止」抗原結合分子もしくは「阻止」抗体または「アンタゴニスト」抗原結合分子もしくは「アンタゴニスト」抗体は、それが結合する抗原の生物学的活性を（部分的にまたは完全にのいずれでも）有意に阻害する抗原結合分子または抗体である。

抗原
　本明細書で用いられる用語「抗原」は、抗原結合部分が結合するポリペプチド巨大分子上の部位（例えば、連続した一続きのアミノ酸、または非連続アミノ酸の別々の領域から構成される立体構造）を指し、抗原結合部分-抗原複合体を形成する。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面上に、ウイルス感染細胞の表面上に、他の疾患細胞の表面上に、免疫細胞の表面上に、血清中に遊離した状態で、および/または細胞外基質（ECM）中に見出すことができる。別段示さない限り、本明細書において抗原と称されるタンパク質（例えば、CD3、CD137、DLL3）は、霊長類（例えば、ヒト）およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物供給源由来のタンパク質の任意の天然形態であり得る。特定の態様において、抗原はヒトCD3、ヒトCD137、またはヒトDLL3である。本明細書において特定のタンパク質への言及がなされる場合、該用語は、「全長」の、プロセシングを受けていないタンパク質、ならびに細胞中でのプロセシングによって生じるタンパク質の任意の形態を包含する。該用語はまた、タンパク質の天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアントまたは対立遺伝子バリアントも包含する。

低下したFcγ受容体結合活性を有するFc領域
　本明細書において、「低下したFcγ受容体結合活性」は、例えば、上記に記載される分析方法に基づき、試験抗原結合分子または抗体の競合活性が、対照抗原結合分子または抗体の競合活性の、50％以下、好ましくは45％以下、40％以下、35％以下、30％以下、20％以下、または15％以下、特に好ましくは10％以下、9％以下、8％以下、7％以下、6％以下、5％以下、4％以下、3％以下、2％以下、または1％以下であることを意味する。

　モノクローナルIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4抗体のFcドメインを含む抗原結合分子または抗体は、対照抗原結合分子または抗体として適宜用いることができる。Fcドメイン構造は、配列番号：1（RefSeqアクセッション番号AAC82527.1のN末端にAが付加される）、配列番号：2（RefSeqアクセッション番号AAB59393.1のN末端にAが付加される）、配列番号：3（RefSeqアクセッション番号CAA27268.1のN末端にAが付加される）、および配列番号：4（RefSeqアクセッション番号AAB59394.1のN末端にAが付加される）に示される。さらに、特定のアイソタイプの抗体のFcドメイン変異体を含む抗原結合分子または抗体が試験物質として用いられる場合、Fcγ受容体結合活性に対する変異体の変異の作用は、同じアイソタイプのFcドメインを含む抗原結合分子または抗体を対照として用いて評価される。上記に記載されるように、そのFcγ受容体結合活性が低下していると判断されているFcドメイン変異体を含む抗原結合分子または抗体が、適切に調製される。

　そのような公知の変異体としては、例えば、アミノ酸231A～238S（EUナンバリング）の欠失を有する変異体（WO 2009/011941）、ならびに変異体 C226S、C229S、P238S、（C220S）（J. Rheumatol (2007) 34, 11）；C226SおよびC229S（(Hum. Antibod. Hybridomas (1990) 1(1), 47-54）；C226S、C229S、E233P、L234V、およびL235A（Blood (2007) 109, 1185-1192）が挙げられる。

　具体的には、好ましい抗原結合分子または抗体には、特定のアイソタイプの抗体のFcドメインを形成するアミノ酸において、以下のアミノ酸位置：220位、226位、229位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、264位、265位、266位、267位、269位、270位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、325位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、439位、445位、449位、または451位（EUナンバリング）から選択される少なくとも1つのアミノ酸の変異（例えば、置換）を有するFcドメインを含むものが含まれる。Fcドメインの起源である抗体のアイソタイプは特に限定されず、モノクローナルIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4抗体に由来する適切なFcドメインを用いることが可能である。IgG1抗体に由来するFcドメインを用いることが好ましい。

　好ましい抗原結合分子または抗体には、例えば、その位置が、IgG1抗体のFcドメインを形成するアミノ酸におけるEUナンバリングにより指定されている（各数字がEUナンバリングでのアミノ酸残基の位置を表し；かつ数字の前にある1文字アミノ酸記号が置換前のアミノ酸残基を表し、数字の後にある1文字アミノ酸記号が置換後のアミノ酸残基を表す）、以下に示される置換：
　（a）L234F、L235E、P331S；
　（b）C226S、C229S、P238S；
　（c）C226S、C229S；または
　（d）C226S、C229S、E233P、L234V、L235A
　（e）L439M、A445N、R449Q、E451S
　（f）M428L、N434A、Q438R、S440E
のいずれか1つを有するFcドメインを含むもの、ならびに231位から238位にあるアミノ酸配列の欠失を有するFcドメインを有するものが含まれる。

　さらに、好ましい抗原結合分子または抗体にはまた、その位置が、IgG2抗体のFcドメインを形成するアミノ酸におけるEUナンバリングにより指定されている、以下に示される置換：
　（e）H268Q、V309L、A330S、およびP331S；
　（f）V234A；
　（g）G237A；
　（h）V234AおよびG237A；
　（i）A235EおよびG237A；または
　（j）V234A、A235E、およびG237A
のいずれか1つを有するFcドメインを含むものも含まれる。各数字はEUナンバリングでのアミノ酸残基の位置を表し；かつ数字の前にある1文字アミノ酸記号は置換前のアミノ酸残基を表し、数字の後にある1文字アミノ酸記号は置換後のアミノ酸残基を表す。

　さらに、好ましい抗原結合分子または抗体にはまた、その位置が、IgG3抗体のFcドメインを形成するアミノ酸におけるEUナンバリングにより指定されている、以下に示される置換：
　（k）F241A；
　（l）D265A；または
　（m）V264A
のいずれか1つを有するFcドメインを含むものも含まれる。各数字はEUナンバリングでのアミノ酸残基の位置を表し；かつ数字の前にある1文字アミノ酸記号は置換前のアミノ酸残基を表し、数字の後にある1文字アミノ酸記号は置換後のアミノ酸残基を表す。

　さらに、好ましい抗原結合分子または抗体にはまた、その位置が、IgG4抗体のFcドメインを形成するアミノ酸におけるEUナンバリングにより指定されている、以下に示される置換：
　（n）L235A、G237A、およびE318A；
　（o）L235E；または
　（p）F234AおよびL235A
のいずれか1つを有するFcドメインを含むものも含まれる。各数字はEUナンバリングでのアミノ酸残基の位置を表し；かつ数字の前にある1文字アミノ酸記号は置換前のアミノ酸残基を表し、数字の後にある1文字アミノ酸記号は置換後のアミノ酸残基を表す。

　他の好ましい抗原結合分子または抗体には、例えば、IgG1抗体のFcドメインを形成するアミノ酸における233位、234位、235位、236位、237位、327位、330位、または331位（EUナンバリング）にあるいずれかのアミノ酸が、対応するIgG2またはIgG4における対応するEUナンバリングでの位置のアミノ酸に置換されているFcドメインを含むものが含まれる。

　好ましい抗原結合分子または抗体にはまた、例えば、IgG1抗体のFcドメインを形成するアミノ酸における234位、235位、および297位（EUナンバリング）にあるアミノ酸のいずれか1つまたは複数が他のアミノ酸に置換されているFcドメインを含むものも含まれる。置換後のアミノ酸の種類は特に限定されない；しかしながら、234位、235位、および297位にあるアミノ酸のいずれか1つまたは複数がアラニンに置換されているFcドメインを含む抗原結合分子または抗体が特に好ましい。

　好ましい抗原結合分子または抗体にはまた、例えば、IgG1抗体のFcドメインを形成するアミノ酸における265位（EUナンバリング）にあるアミノ酸が別のアミノ酸に置換されているFcドメインを含むものも含まれる。置換後のアミノ酸の種類は特に限定されない；しかしながら、265位にあるアミノ酸がアラニンに置換されているFcドメインを含む抗原結合分子または抗体が特に好ましい。

（優先的）濃縮（または増加）
　用語「（優先的に）濃縮させる（または増加させる）」は、望ましい形態の相対的存在量の増加、または望ましい形態の相対的割合の増加、または望ましい形態（構造アイソフォーム）の集団の増加を意味する。いくつかの態様において、本明細書に記載される方法は、抗体の構造アイソフォーム、例えば、ヒンジ領域外のアミノ酸残基間に形成される少なくとも1つのジスルフィド結合を有する抗体などの相対的存在量を増加させる。1つの態様において、前記少なくとも1つのジスルフィド結合は、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインの各々のCH1領域におけるEUナンバリングによる191位にあるアミノ酸残基間に形成される。ある特定の態様において、前記方法は、少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、好ましくは少なくとも95％のモル比の、ヒンジ領域外に形成される少なくとも1つのジスルフィド結合を有する前記抗体を有する、均一な抗体調製物を製造する。

均一性
　抗体の「均一な」集団は、主に単一形態の抗体を含む抗体集団を意味し、例えば、溶液または組成物中の少なくとも50％、60％、70％、80％またはそれを上回る、好ましくは少なくとも90％、95％、96％、97％、99％、または100％の抗体が、適正にフォールディングされた形態をとる。同様に、ヒンジ領域外に形成される少なくとも1つのジスルフィド結合を有する抗体の「均一な」集団は、主に単一の適正にフォールディングされた形態を含む前記抗体の集団、例えば、少なくとも50％、60％、70％、80％またはそれを上回る、好ましくは少なくとも90％、95％、96％、97％、99％、または100％のモル比の、ヒンジ領域外に形成された少なくとも1つのジスルフィド結合を有する前記抗体を意味する。1つの好ましい態様において、抗体の前記「均一な」集団は、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインの各々のCH1領域におけるEUナンバリングによる191位にあるアミノ酸残基（すなわち、CH1領域におけるEUナンバリングによる191位にある「対をなすシステイン」）間に形成される少なくとも1つのジスルフィド結合を含む。

　抗体集団が均一であるかどうか、および混合物中のタンパク質/抗体の立体構造の相対的な存在量または割合の決定は、種々の分析技術および/または定性技術のいずれかを用いて行うことができる。2つの立体構造が分離技術、例えば、クロマトグラフィー、電気泳動、濾過、または他の精製技術の間に異なって分離される場合、混合物中の立体構造の相対的割合は、そのような精製技術を用いて決定することができる。例えば、組換えIgGの少なくとも2つの異なる立体構造は、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって分離することができる。さらに、遠紫外域円偏光二色性はタンパク質の二次構造の構成を推定するために用いられている（Perczel et al., 1 991, Protein Engrg. 4:669-679）ことから、そのような技術は、タンパク質の代替立体構造が存在するかどうかを決定することができる。立体構造を決定するのに用いられるさらに別の技術は、トリプトファンおよびチロシン蛍光に割り当て可能な、三次構造における相補的な相違を確認するために利用することができる蛍光分光法である。立体構造の相違、その結果、立体構造の相対的割合を決定するために用いることができる他の技術は、凝集状態を測定するためのオンラインSEC、融解転移（Tm）および成分エンタルピーを測定するための示差走査熱量測定、およびカオトロープアンフォールディングである。立体構造の相違、その結果、立体構造の相対的割合を決定するために用いることができるさらに別の技術は、タンパク質の不均一性を決定するためのLC/MS検出である。

　あるいは、抗体/タンパク質の立体構造間で活性の相違が存在する場合、混合物中の立体構造の相対的割合の決定は、活性アッセイ（例えば、リガンドへの結合、酵素活性、生物学的活性等）によって行うことができる。タンパク質の生物学的活性もまた、用いることができる。あるいは、活性単位/ mgタンパク質として活性が表される結合アッセイを用いることができる。

　抗体/タンパク質の不均一性を決定するために、IECクロマトグラフィーが用いられる。そのような場合、抗体は、精製されるか、または他のポリペプチドに対応するポリペプチドのピークまたは画分がIECクロマトグラフィーによる分析時に検出されないことを意味する、「均一」であるとみなされる。ある特定の態様において、抗体は、精製されるか、または「均一」であるとみなされ、その場合、他のポリペプチドに対応するポリペプチドのバンドがSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）による分析時に検出されない。関連する分野における当業者は、差次的なグリコシル化および差次的な翻訳後プロセシング等に起因して、ポリペプチドに対応する複数のバンドがSDS-PAGEによって可視化できることを認識している。最も好ましくは、ポリペプチドは、SDS-PAGEによる分析時に単一のポリペプチドのバンドによって示されるように、実質的に均一に精製される。ポリペプチドのバンドは、銀染色、クーマシーブルー染色、および/または（ポリペプチドが放射標識される場合には）オートラジオグラフィーによって可視化できる。

　本明細書において、SDS-PAGE分析の条件の例は以下のとおりである。非還元SDS-PAGEを、4～20％ Mini-PROTEAN（登録商標）TGX Stain-Free(商標)Precast Gels（Bio-Rad）を1×Tris/グリシン/SDSランニングバッファー（Bio-Rad）と共に用いて実施する。モノクローナル抗体試料を70℃にて10分間加熱する。0.2マイクログラムをロードし、電気泳動を200 Vにて90分間実行する。タンパク質をChemidoc Imaging System（Bio-Rad）で可視化する。個々のバンドのパーセンテージを、Image Labソフトウェアバージョン6.0（Bio-Rad）によって分析し、個々のバンド（例えば、早い泳動（下側のバンド）および遅い泳動（上側のバンド））の％強度を、バンドの強度をこれら2つのバンドの合計で割ることによって算出する。次に、ゲルをCBBで染色してもよく、ゲル画像を取り込んでもよく、バンドを画像化デバイスを用いて定量化してもよい。ゲル画像において、複数、例えば2本のバンド、すなわち、「上側のバンド」および「下側のバンド」が、抗体バリアント試料で観察されてもよい。この場合では、上側のバンドの分子量は、親抗体（改変前）のものに対応し得る。Fabのジスルフィド結合を介する架橋形成などの構造変化がシステイン置換によって引き起こされる可能性があり、これは電気泳動移動度の変化をもたらし得る。この場合では、下側のバンドは、CH1領域間に形成される1つまたは複数の操作されたジスルフィド結合を有する抗体に対応するとみなされ得る。追加のシステイン置換を有する抗体バリアント試料は、対照試料と比較して、高い上側のバンドに対する下側バンドの比率を示し得る。追加のシステイン残基は、Fabのジスルフィド結合架橋形成を増強/促進し得；変異位置に形成される操作されたジスルフィド結合を有する抗体調製物のパーセンテージまたは構造均一性を増加させ得；変異位置に形成される操作されたジスルフィド結合を有さない抗体調製のパーセンテージを減少させ得る。本明細書において、用語「上側のバンドに対する下側のバンドの比率」は、上述のSDS-PAGE試験時に定量化され得る上側のバンドの量/強度と下側のバンドの量/強度との間の比率を指す。

　用語「薬学的製剤」および「医薬組成物」は、その中に含まれる有効成分の生物学的活性が効果を発揮し得るような形態にある調製物であって、かつ製剤が投与される被験体に許容できない程度に毒性のある追加の要素を含んでいない、調製物のことをいう。

　「薬学的に許容される担体」は、被験体に対して無毒な、薬学的製剤中の有効成分以外の成分のことをいう。薬学的に許容される担体は、これらに限定されるものではないが、緩衝液、賦形剤、安定化剤、または保存剤を含む。

　「個体」または「被験体」は哺乳動物である。哺乳動物は、これらに限定されるものではないが、飼育動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、およびサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、ならびに、げっ歯類（例えば、マウスおよびラット）を含む。特定の態様では、個体または被験体は、ヒトである。

ＩＩ．抗原結合分子を含む調製物の製造方法
　本開示は、ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間で形成される少なくとも１つのジスルフィド結合を有する抗原結合分子を含む調製物の製造方法に関する。本開示における方法は、還元剤存在下で、ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間で形成される少なくとも１つのジスルフィド結合を有する抗原結合分子と当該抗原結合分子のジスルフィド結合のミスマッチ体および／または形成不全体を含む混合物（以下、本明細書において、「抗原結合分子を含む混合物」、「抗原結合分子の混合物」等と称される場合がある）を、クロマトグラフィーに供する工程を含む。本開示における方法においては、抗原結合分子を含む混合物を、１種類のクロマトグラフィーについて１回または複数回の処理に供することができる。あるいは、抗原結合分子を含む混合物を、複数種類（例えば、２種類、３種類、またはそれ以上）のクロマトグラフィーのそれぞれについて、１回または複数回（例えば、２回、３回、またはそれ以上）の処理に供することができる。クロマトグラフィーの処理を複数回行う場合には、それらは連続していても、連続していなくてもよい。

　本開示における方法において、クロマトグラフィーは当業者に周知のものを用いることができる。例えばカラムクロマトグラフィー、膜クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーなどを例示することができるがこれらに限定されない。

　本開示の製造方法において、抗原結合分子を含む混合物をクロマトグラフィーに供する工程は、還元剤存在下において行われる。本開示の製造方法においては、抗原結合分子を含む混合物をクロマトグラフィーに供する工程において還元剤が存在している限り、その態様は問わない。例えば、あらかじめ抗原結合分子をクロマトグラフィーの担体に担持させた後、抗原結合分子と還元剤とを接触させてもよいし、抗原結合分子を含む混合物と還元剤とを混ぜ合わせたものをクロマトグラフィーに通液させてもよい。

　一局面において、カラムクロマトグラフィーが用いられる場合、本開示の方法は、カラムクロマトグラフィーのカラム内に充填されたクロマトグラフィー担体と、ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間で形成される少なくとも１つのジスルフィド結合を有する抗原結合分子と当該抗原結合分子のジスルフィド結合のミスマッチ体および／または形成不全体を含む混合物とを接触させる工程を含むことができる。また一局面において、膜クロマトグラフィーが用いられる場合、本開示の方法は、膜クロマトグラフィーの膜上に塗布されたクロマトグラフィー担体と、ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間で形成される少なくとも１つのジスルフィド結合を有する抗原結合分子と当該抗原結合分子のジスルフィド結合のミスマッチ体および／または形成不全体を含む混合物とを接触させる工程を含むことができる。抗原結合分子を含む混合物はあらかじめ還元剤と接触されたものであってもよい。

　本開示において、ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間で形成される少なくとも１つのジスルフィド結合を有する抗原結合分子と当該抗原結合分子のジスルフィド結合のミスマッチ体および／または形成不全体を含む混合物をクロマトグラフィーに供する工程は、以下の工程を含むことができる。
（ａ）ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間で形成される少なくとも１つのジスルフィド結合を有する抗原結合分子と当該抗原結合分子のジスルフィド結合のミスマッチ体および／または形成不全体を含む混合物と、還元剤を含む溶液とを接触させる工程、および
（ｂ）還元剤を除去する工程。

　一局面において、本開示の方法により、本明細書において記載される段階によって、均一な抗原結合分子の集団または均一な抗原結合分子の調製物または濃縮物が製造または精製される。

　一局面において、本開示の方法により、担体に担持された、ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間で少なくとも１つのジスルフィド結合を形成しうるアミノ酸残基を有する抗原結合分子（このような抗原結合分子は、ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間に少なくとも１つのジスルフィド結合が適切に形成されている抗原結合分子、および、ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間に少なくとも１つのジスルフィド結合が適切に形成されていない抗原結合分子、つまり当該抗原結合分子のジスルフィド結合のミスマッチ体および／または形成不全体を含む）に対する、ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間に少なくとも１つのジスルフィド結合を有する抗原結合分子の割合を増加させることができる。

　一局面において、本開示の方法により、担体に担持された、ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間で少なくとも１つのジスルフィド結合を形成しうるアミノ酸残基を有する抗原結合分子（このような抗原結合分子は、ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間に少なくとも１つのジスルフィド結合が適切に形成されている抗原結合分子、および、ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間で少なくとも１つのジスルフィド結合が適切に形成されていない抗原結合分子、つまり当該抗原結合分子のジスルフィド結合のミスマッチ体および／または形成不全体を含む）に対して、モル比で、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の、ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間に少なくとも１つのジスルフィド結合を有する抗原結合分子が製造される。

　したがって、一態様において本開示は、増加した濃度の、ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間で形成される少なくとも１つのジスルフィド結合を有する抗原結合分子を含む調製物の製造方法に関する。一態様において、本開示の方法によって製造される調製物は、ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間で形成される少なくとも１つのジスルフィド結合を有する抗原結合分子の濃縮物であることができる。また、一態様において本開示は、抗原結合分子の混合物における、ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間で形成される少なくとも１つのジスルフィド結合を有する抗原結合分子の濃度を増加させる方法に関する。さらなる態様において、本開示は、ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間で形成される少なくとも１つのジスルフィド結合を有する抗原結合分子および当該抗原結合分子のジスルフィド結合のミスマッチ体および／または形成不全体を含む混合物から、ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間で形成される少なくとも１つのジスルフィド結合を有する抗原結合分子を含む調製物を精製する方法に関する。本開示において、ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間で形成されるジスルフィド結合を有さない抗原結合分子には、ヒンジ領域以外の領域におけるシステイン残基がキャップされたもの、システインのまま存在するもの等が含まれる。

　本開示の方法においては、抗原結合分子の混合物と還元剤を含む溶液とが接触される。特定の態様において、クロマトグラフィー内において、担体に担持された抗原結合分子の混合物と還元剤を含む溶液とが接触される。一局面において、本開示におけるクロマトグラフィー担体としてアフィニティクロマトグラフィー担体、イオン交換クロマトグラフィー担体、疎水性相互作用クロマトグラフィー担体、イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーの両方を含むマルチモードクロマトグラフィー担体、およびハイドロキシアパタイト担体等が挙げられるがこれらに限定されない。本開示において、「担体」、「樹脂」、「リガンド」、「基質」は互換的に用いられる。

　本開示においてアフィニティクロマトグラフィー担体は、アフィニティクロマトグラフィーの作用を示す限り限定されない。一局面において、アフィニティクロマトグラフィー担体として、プロテインＡ担体、プロテインＧ担体、プロテインＬ担体、配列選択的なペプチド担体、または抗原結合分子に選択的に結合する担体等を例示することができるがこれらに限定されない。

　本開示の方法においては、アフィニティクロマトグラフィー担体は、商業的に入手可能なものを用いることができる。具体的な局面において、アフィニティクロマトグラフィー担体として、
　MabSelect SuRe（登録商標）（Cytiva社）、
　MabSelect Xtra（登録商標）（Cytiva社）、
　MabSelect SuRe（登録商標）LX（Cytiva社）、
　MabSelect SuRe（登録商標）pcc（Cytiva社）、
　MabSelect PrismA（登録商標）（Cytiva社）、
　MabSpeed（登録商標） rP202（Cytiva社）、
　TOYOPEARL（登録商標） rProtein A HC-650F（TOSOH社）、
　Praesto（登録商標） Jetted A50（Purolite社）、
　Amsphere（登録商標） A3 (JSR社)、
　Amsphere（登録商標） Protein A JWT203 (JSR社)、
　Eshmuno A（登録商標） (Merck Millipore社)、
　Capto L（登録商標）（Cytiva社）、および
　MabSelect（登録商標） VL（Cytiva社）
等を例示することができるが、これらに限定されない。

　一局面において、本開示におけるイオン交換クロマトグラフィー担体は、陰イオン交換樹脂（陰イオン交換リガンド）または陽イオン交換樹脂（陽イオン交換リガンド）を含む。本開示における陰イオン交換樹脂および陽イオン交換樹脂は、それぞれ陰イオン交換作用および陽イオン交換作用を示す限り限定されない。

　本開示の方法においては、陰イオン交換クロマトグラフィー担体は、商業的に入手可能なものを用いることができる。具体的な局面において、陰イオン交換クロマトグラフィー担体として、
　YMC-BioPro（ワイエムシィ社）、
　Q Sepharose（登録商標）High Performance（Cytiva社）、
　Q Sepharose（登録商標） Fast Flow（Cytiva社）、
　Q Sepharose（登録商標） XL（Cytiva社）、
　Q Sepharose（登録商標） Big Beads（Cytiva社）、
　Capto（登録商標） Q ImpRes（Cytiva社）、
　Capto（登録商標） Q（Cytiva社）、
　Capto（登録商標） Q XP（Cytiva社）、
　Capto（登録商標） DEAE（Cytiva社）、
　SOURCE（登録商標） 30Q（Cytiva社）、
　SOURCE（登録商標） 15Q（Cytiva社）、
　DEAE Sepharose（登録商標） Fast Flow（Cytiva社）、
　ANX Sepharose（登録商標） 4 Fast Flow（Cytiva社）、
　POROS（登録商標） 50 PI（Thermo Fisher社）、
　POROS（登録商標） 50 HQ（Thermo Fisher社）、
　POROS（登録商標） HQ（Thermo Fisher社）、
　POROS（登録商標） D（Thermo Fisher社）、
　POROS（登録商標） PI（Thermo Fisher社）、
　Eshumuno（登録商標） Q（Merck Millipore社）、
　Fractogel（登録商標） TMAE（Merck Millipore社）、
　Fractogel（登録商標） DEAE（Merck Millipore社）、
　Macro-Prep（登録商標） Q（Bio-Rad Laboratories社）、
　Macro-Prep（登録商標） DEAE（Bio-Rad Laboratories社）、
　Giga Cap（登録商標） Q-650M（TOSOH社）、
　Giga Cap（登録商標） DEAE-650M（TOSOH社）、および
　Q HyperCel（登録商標）（PALL社）
等を例示することができるが、これらに限定されない。

　また陽イオン交換クロマトグラフィー担体も商業的に入手可能なものを用いることができる。具体的な局面において、陽イオン交換クロマトグラフィー担体として、
　Capto（登録商標） S（Cytiva社）、
　Capto（登録商標）SP ImpRes（Cytiva社）、
　Capto（登録商標） S ImpaAct（Cytiva社）、
　SP Sepharose（登録商標） Fast Flow（Cytiva社）、
　CM Sepharose（登録商標） Fast Flow（Cytiva社）、
　SP Sepharose（登録商標） High Performance（Cytiva社）、
　CM Sepharose（登録商標） High Performance（Cytiva社）、
　SP Sepharose（登録商標） XL（Cytiva社）、
　SP Sepharose（登録商標） Big Beads（Cytiva社）、
　Eshumuno（登録商標） CPX（Merck Millipore社）、
　Eshumuno（登録商標） CP-FT（Merck Millipore社）、
　POROS（登録商標） 50HS（Thermo Fisher社）、および
　POROS（登録商標） XS（Thermo Fisher社）
等を例示することができるが、これらに限定されない。

　本開示において疎水性相互作用クロマトグラフィーのための担体は、疎水性相互作用クロマトグラフィー作用を示す限り限定されない。一局面において、疎水性相互作用クロマトグラフィー担体は、疎水性リガンドを含む。

　本開示の方法においては、疎水性相互作用クロマトグラフィー担体は、商業的に入手可能なものを用いることができる。特定の局面において、疎水性相互作用クロマトグラフィー担体として、
　Phenyl Sepharose（登録商標） High Performance（Cytiva社）、
　Butyl Sepharose（登録商標） High Performance（Cytiva社）、
　Phenyl Sepharose（登録商標） 6 Fast Flow（Cytiva社）、
　Butyl-S Sepharose（登録商標） 6 Fast Flow（Cytiva社）、
　Butyl Sepharose（登録商標） 4 Fast Flow（Cytiva社）、
　Octyl Sepharose（登録商標） 4 Fast Flow（Cytiva社）、
　Capto（登録商標） Phenyl ImpRes（Cytiva社）、
　Capto（登録商標） Phenyl（Cytiva社）、
　Capto（登録商標） Phenyl (High Sub)（Cytiva社）、
　Capto（登録商標） Butyl（Cytiva社）、
　Capto（登録商標） Butyl ImpRes（Cytiva社）、
　Capto（登録商標） Octyl（Cytiva社）、
　Phenyl Sepharose（登録商標） 6 Fast Flow (Low Sub)（Cytiva社）、
　Phenyl Sepharose（登録商標） 6 Fast Flow (High Sub)（Cytiva社）、
　POROS（登録商標） Ethyl（Thermo Fisher社）、
　Fractogel（登録商標） Phenyl（Merck Millipore社）、
　Fractogel（登録商標） Propyl（Merck Millipore社）、
　TOYOPEARL（登録商標） Butyl（TOSOH社）、
　TOYOPEARL（登録商標） Ether（TOSOH社）、
　TOYOPEARL（登録商標） Hexyl（TOSOH社）、
　TOYOPEARL（登録商標） Phenyl（TOSOH社）、
　TOYOPEARL（登録商標） PPG（TOSOH社）、
　TOYOPEARL（登録商標） Super Butyl（TOSOH社）、
　TOYOPEARL（登録商標） Butyl-600（TOSOH社）、
　TOYOPEARL（登録商標） Phenyl-650C（TOSOH社）、
　TOYOPEARL（登録商標） Phenyl-650M（TOSOH社）、
　TOYOPEARL（登録商標） Phenyl-650S（TOSOH社）、
　TOYOPEARL（登録商標） Phenyl-600M（TOSOH社）、および
　Macro-Prep（登録商標） HIC（Bio-RadLaboratories社）
等を例示することができるが、これらに限定されない。

　一局面において、本開示におけるマルチモードクロマトグラフィー担体は、陽イオン交換リガンドと疎水性リガンドを組み合わせた担体、または陰イオン交換リガンドと疎水性リガンドを組み合わせた担体を含むことができる。本開示の方法においては、マルチモードクロマトグラフィー担体は商業的に入手可能なものを用いることができる。例えば、マルチモードクロマトグラフィーのための担体として、
　Capto（登録商標） adhere（Cytiva社）、
　Capto（登録商標） adhere ImpRes（Cytiva社）、
　Capto（登録商標） MMC（Cytiva社）、
　Capto（登録商標） MMC ImpRes（Cytiva社）、および
　Eshmuno（登録商標） CMX（Merck Millipore社）
等を例示することができるが、これらに限定されない。

　一局面において、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー担体は、ハイドロキシアパタイトもしくはその転換体（フルオロアパタイトなど）を含むことができる。本開示の方法においては、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー担体も商業的に入手可能なものを用いることができる。特定の態様において、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーのための担体としては、
　Ceramic Hydroxyapatite（登録商標） Type I（Bio-Rad Laboratories社）、
　Ceramic Hydroxyapatite（登録商標） Type II（Bio-Rad Laboratories社）、
　Ceramic Fluoroapatite（登録商標）（Bio-Rad Laboratories社）、
　MPC（登録商標） Ceramic Hydroxyfluoroapatite（Bio-Rad Laboratories社）、
　HA Ultrogel（登録商標）（PALL社）、および
　Ca++Pure-HA（登録商標）（TOSOH社）
などを例示することができるがこれらに限定されない。

　本開示の方法においては、膜クロマトグラフィーも商業的に入手可能なものを用いることができる。特定の態様において、膜クロマトグラフィーのための製品として、
　Mustang（登録商標） Q（PALL社）、
　Mustang（登録商標） S（PALL社）、
　Sartobind（登録商標） Q（Sartorius社）、
　Sartobind（登録商標） S（Sartorius社）、
　Sartobind（登録商標） STIC（Sartorius社）、
　Sartobind（登録商標） protein A（Sartorius社）、
　Fibro（Cytiva社）、
　Protein capture（GORE社）、
　Natrix（登録商標） Q（Merck Millipore社）、
　Purexa（登録商標）-MQ (Purilogics社)、
　Purexa（登録商標）-A (Purilogics社)、および
　Purexa（登録商標）-DMAE (Purilogics社)、
などを例示することができるがこれらに限定されない。

　本開示において、用語「還元試薬」、「還元剤」、および「還元剤を含む溶液」は互換的に用いられる。いくつかの態様において、前記還元剤は遊離チオールである。また一局面において、本開示における還元剤はモノチオール、ジチオール、ホスフィン、または無機試薬であることができる。本開示におけるモノチオールとしてグルタチオン、システイン、リポ酸、２－メルカプトエタノール、２－MEA等を例示することができるが、これらに限定されない。本開示におけるジチオールとしてDTT（ジチオトレイトール）、DTE、DTBA等を例示することができるが、これらに限定されない。本開示におけるホスフィンとしてTCEP（トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン）、THPP等を例示することができるが、これらに限定されない。本開示における無機試薬として亜硫酸ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム等を例示することができるが、これらに限定されない。

　還元試薬は好ましくは、グルタチオン（GSH）、ジチオスレイトール（DTT）、2-メルカプトエタノール、2-アミノエタンチオール（2-MEA）、TCEP（トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン）、ジチオニトロベンゾアート、システイン、亜硫酸ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウムおよびNa₂SO₃からなる群より選択される化合物で構成される。いくつかの態様において、TCEP、2-MEA、DTT、システイン、GSH、またはNa₂SO₃を用いることができる。いくつかの好ましい態様において、システインを用いることができる。いくつかの好ましい態様において、TCEPを用いることができる。本開示の方法においては、還元剤を１種類または複数種類（例えば２種類、３種類、またはそれ以上）を使用してもよい。

　一態様において、還元剤は溶液、好ましくは緩衝液の態様であることができる。緩衝液として、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酒石酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等、クロマトグラフィー技術において用いられる緩衝液を例示することができるが、これらに限定されない。また塩基として、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、Trisなどを例示することができる。

　本開示において「接触させる」とは、抗原結合分子の混合物を、還元剤を含む溶液に供すること、曝露すること、あるいは抗原結合分子の混合物と還元剤を含む溶液とを混合することを意味する。本開示における方法においては、抗原結合分子の混合物は、固体支持体（例えば、カラムクロマトグラフィーのカラムまたは膜クロマトグラフィーの膜）に結合させた状態で、還元剤を含む溶液と接触させることができる。

　以下の理論に拘束されるものではないが、unLINCフォーマット（すなわち、操作されたジスルフィド結合または「対をなすシステイン」を有さない二価または三価の抗原結合分子）の存在は、対をなさないCys残基を「キャップ」してLINC形成（ヒンジ領域以外の領域における操作されたジスルフィド結合の形成）を妨げるシステイン化（cysteinylation）およびグルタチオン化（glutathionylation）など、遊離チオール基を含有する分子とジスルフィド結合を多くの場合形成する、対をなさないCys残基に起因する可能性があると考えられる。対をなさないシステインのキャップされた分子を除去するために、還元剤は表面システインの脱キャップを助けることができ、脱キャップされた抗原結合分子のさらなる再酸化（例えば、還元試薬の除去による）は、LINC形成のための脱キャップされたシステイン間のジスルフィド結合形成を促進することができる。したがって、還元および再酸化によるunLINCフォーマットにおける対をなさないスルフヒドリルからのシステイン化の除去は、unLINCフォーマットを除去し、抗体の均一性を向上させることができる。

　一局面において、本開示の方法においては、抗原結合分子の混合物と還元剤を含む溶液との接触により、抗原結合分子において、ジスルフィド結合を形成しうるアミノ酸残基間で形成されていたジスルフィド結合が切断される。一局面において、抗原結合分子の混合物と還元剤を含む溶液との接触により、抗原結合分子において、キャップされたシステイン残基が脱キャップされる。

　一局面において、本開示の方法においては、還元剤の除去により、抗原結合分子において、ジスルフィド結合を形成しうるアミノ酸残基間でジスルフィド結合が形成される。

　抗原結合分子の混合物と還元剤を含む溶液との接触は、望ましい立体構造の相対的割合を増加させるのに十分な時間にわたって実施される。割合のいかなる相対的増加でも望ましく、例えば、望ましくない立体構造を有する抗原結合分子の少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％が、望ましい立体構造を有する抗原結合分子に変換されることを含む。

　一局面において、本開示の方法においては、還元剤を含む溶液は、抗原結合分子が担持された担体を含むクロマトグラフィー内を通液される。ある特定の態様において、抗原結合分子はクロマトグラフィーの担体に固定化された固定相を構成し、還元剤を含む溶液は移動相の一部である。この場合、接触は、クロマトグラフィー精製手法の一部として実施され得る。

　還元剤は、望ましい立体構造（例えば、抗体の2つのFab間、例えばヒンジ領域以外の領域間に1つまたは複数の操作されたジスルフィド結合を有する「対をなすシステイン」形態の抗原結合分子）の相対的割合を増加させるのに十分な濃度で存在する。還元剤の最適絶対濃度およびモル比は、総抗原結合分子および一部の状況では特定の抗原結合分子の濃度によって決まる。また還元剤の濃度は、抗原結合分子中の対をなさないシステインの数およびアクセスのし易さによっても決まる。

　一局面において、還元剤の濃度は、約０．０００１ｍＭ、約０．０００５ｍＭ、約０．００１ｍＭ、約０．００５ｍＭ、約０．０１ｍＭ、約０．０５ｍＭ、約０．１ｍＭ、約０．５ｍＭ、および約１．０ｍＭからなる群より選択される下限と、約１００．０ｍＭ、約７５．０ｍＭ、約５０．０ｍＭ、約２５．０ｍＭ、約１０．０ｍＭ、約５．０ｍＭ、約１．０ｍＭ、約０．５ｍＭ、約０．１ｍＭ、および約０．０１ｍＭからなる群より選択される上限の任意の組み合わせによって特定することが可能な範囲を例示することができる。いくつかの態様において、還元剤の濃度として、約０．００００１ｍＭ～約１０．０ｍＭ、約０．００００５ｍＭ～約５．０ｍＭ、約０．０００１ｍＭ～約１．０ｍＭ、約０．０００５ｍＭ～約０．５ｍＭ、約０．００１ｍＭ～約０．１ｍＭ、または約０．００１ｍＭ～約０．０１ｍＭの範囲を例示することができる。更なる態様において、還元剤の濃度として、約０．００１ｍＭ～約１００．０ｍＭ、約０．００５ｍＭ～約７５．０ｍＭ、約０．０１ｍＭ～約５０．０ｍＭ、約０．０５ｍＭ～約２５．０ｍＭ、または約０．１ｍＭ～約１０ｍＭの範囲を例示することができる。更なる態様において、還元剤の濃度として、約０．０００１ｍＭ～約１００．０ｍＭ、約０．０００５ｍＭ～約５０．０ｍＭ、約０．００１ｍＭ～約１０．０ｍＭ、約０．００５ｍＭ～約５．０ｍＭ、約０．０１ｍＭ～約１．０ｍＭの範囲を例示することができる。特定の態様において、還元剤の濃度は、約０．００１ｍＭ、約０．０１ｍＭ、約０．１ｍＭ、約０．１５ｍＭ、約１．０ｍＭ、または約１０．０ｍＭであることができる。

　いくつかの好ましい態様において、還元剤がシステインの場合、還元剤の濃度は、約０.０１ｍＭ～約１００．０ｍＭ、約０.０５ｍＭ～約５０．０ｍＭ、約０.１ｍＭ～約１０．０ｍＭ、または約０.５ｍＭ～約５．０ｍＭであることができる。更なる好ましい態様において、還元剤がシステインの場合、還元剤の濃度は、約０．００１ｍＭ～約１００．０ｍＭ、約０．００５ｍＭ～約７５．０ｍＭ、約０．０１ｍＭ～約５０．０ｍＭ、約０．０５ｍＭ～約２５．０ｍＭ、または約０．１ｍＭ～約１０ｍＭであることができる。更なる好ましい態様において、還元剤がシステインの場合、還元剤の濃度は、約０．０００１ｍＭ～約１００．０ｍＭ、約０．００１ｍＭ～約７５．０ｍＭ、約０．０１ｍＭ～約５０．０ｍＭ、または約０．１ｍＭ～約１０．０ｍＭであることができる。いくつかの好ましい態様において、還元剤がジチオールの場合、還元剤の濃度は、約０.００１ｍＭ～約１０ｍＭであることができる。いくつかの好ましい態様において、還元剤がホスフィンの場合、還元剤の濃度は、約０．０００１ｍＭ～約１ｍＭまたは約０．００１ｍＭ～約０．０１ｍＭであることができる。いくつかの好ましい態様において、還元剤がＴＣＥＰの場合、還元剤の濃度は、約０．００００１ｍＭ～約１０．０ｍＭ、約０．００００５ｍＭ～約５．０ｍＭ、約０．０００１ｍＭ～約１ｍＭ、約０．０００５ｍＭ～約０．５ｍＭ、約０．００１ｍＭ～約０．１ｍＭ、または約０．００１ｍＭ～約０．０１ｍＭであることができる。いくつかの好ましい態様において、還元剤が無機試薬の場合、還元剤の濃度は、約０．０００１ｍＭ～約１０ｍＭまたは約０．００１ｍＭ～約０．１ｍＭであることができる。

　特定の態様において、還元剤がシステインの場合、還元剤の濃度は、約０．１ｍＭ、約０．１５ｍＭ、約１．０ｍＭ、約１０．０ｍＭ、または約１００ｍＭであることができる。特定の態様において、還元剤がＴＣＥＰの場合、還元剤の濃度は、約０．００１ｍＭ、約０．０１ｍＭ、約０．１ｍＭ、または約１．０ｍＭであることができる。

　望ましい立体構造を有する抗原結合分子の収量を最大化するために、還元剤を含む溶液のｐＨは、抗原結合分子の安定性を保護し、ジスルフィド交換を最適化するように選択される。一局面において、本開示における還元剤を含む溶液のｐＨは、約４．５～約１０．０、約５．０～約９．０、約６．５～約８．５、または約７．０～約８．０であることができる。本発明の１つの非限定的な態様において、最適なｐＨは約７．０、約７．５、または約８．０であることが見出された。しかしながら、本発明の特定の態様での最適ｐＨは、当業者によって実験的に容易に決定することができる。

　本開示の方法においては、クロマトグラフィー担体、抗原結合分子、および還元剤とが、クロマトグラフィー内において接触される。一態様において本開示の方法においては、担体に担持された抗原結合分子と還元剤とがクロマトグラフィー内において接触される。言い換えると、本開示の方法においては、還元剤と抗原結合分子の接触は、還元剤を含む溶液を、担体に担持された抗原結合分子を含むカラムクロマトグラフィーのカラム内または膜クロマトグラフィーのデバイス内を通液させることによって行うことができる。

　いくつかの態様において、還元剤を含む溶液は、約２秒～約８０分もしくは約３秒～約２４分の通過時間でカラムクロマトグラフィーのカラム内もしくは膜クロマトグラフィーのデバイス内を通液される。特定の態様において、還元剤を含む溶液は、約１２分または約３０秒の通過時間でカラムクロマトグラフィーのカラム内もしくは膜クロマトグラフィーのデバイス内を通液される。いくつかの態様において、通液は、カラム内もしくはデバイス内に還元剤を含む溶液が充填された状態で一時的に停止されてもよい。

　一局面において、カラムクロマトグラフィーが用いられる場合、還元剤を含む溶液は、約２分～約８０分または約４分～約２４分の通過時間でカラム内を通液される。特定の態様において、カラムクロマトグラフィーが用いられる場合、還元剤を含む溶液は、約１２分の通過時間でカラム内を通液される。一局面において、通液は、カラム内に還元剤を含む溶液が充填された状態で一時的に停止されてもよい。一局面において、カラムクロマトグラフィーが用いられる場合、本開示における還元剤を含む溶液は、約２５ｃｍ／時間～約５００ｃｍ／時間、約５０ｃｍ／時間～約４００ｃｍ／時間、約７５ｃｍ／時間～約３５０ｃｍ／時間、または約１００ｃｍ／時間～約３００ｃｍ／時間の速度でカラム内を通液させることができる。いくつかの態様において、本開示における還元剤を含む溶液は、約１００ｃｍ／時間の速度でカラム内を通液させることができる。一局面において、通液は、カラム内に還元剤を含む溶液が充填された状態で一時的に停止されてもよい。

　一局面において、膜クロマトグラフィーが用いられる場合、還元剤を含む溶液は、約２秒～約６０分、または約３秒～約６分、例えば約３０秒の通過時間で膜デバイスを通液される。いくつかの態様において、通液は、膜デバイス内に還元剤を含む溶液が充填された状態で一時的に停止されてもよい。一局面において、膜クロマトグラフィーが用いられる場合、本開示における還元剤を含む溶液は、約０．０１７ＭＶ／分～約３０ＭＶ／分、約０．１７ＭＶ／分～約２０ＭＶ／分、約１ＭＶ／分～約１０ＭＶ／分または約２ＭＶ／分～約５ＭＶ／分の速度で膜デバイス内を通液させることができる。また特定の態様において、本開示における還元剤を含む溶液は、約２ＭＶ／分の速度で膜デバイス内を通液させることができる。通液は、膜デバイス内に該溶液が充填された状態で一時的に停止されてもよい。

　還元剤を含む溶液のカラム通液量は特に限定されるものではないが、例えばカラムクロマトグラフィーが用いられる場合、還元剤を含む溶液の通液量は、カラム体積の約０．１倍（約０．１ＣＶ（ｃｏｌｕｍｎ　ｖｏｌｕｍｅ））～約１００倍（約１００ＣＶ）、約１倍（約１ＣＶ）～約２０倍（約２０ＣＶ）、または約３倍（約３ＣＶ）～約１０倍（約１０ＣＶ）であることができる。いくつかの態様において、還元剤を含む溶液のカラム通液量は、カラム体積の約１０倍（約１０ＣＶ）であることができる。また膜クロマトグラフィーが用いられる場合、還元剤を含む溶液の通液量は、膜デバイス体積の約１倍（約１ＭＶ（Ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｖｏｌｕｍｅ））～約５００倍（約５００ＭＶ）、または約２倍（約２ＭＶ）～約１００倍（約１００ＭＶ）であることができる。いくつかの態様において、還元剤を含む溶液のカラム通液量は、カラム体積の約１５倍（約１５ＭＶ）であることができる。

　抗原結合分子の混合物と還元剤を含む溶液との反応時間（接触時間）は特に限定されるものではないが、例えば約６秒～約１４４０分、約１８秒～約３００分、約５分～約１８０分、約１０分～約１５０分、または約１２分～約１２０分を例示することができる。特定の態様において、抗原結合分子の混合物と還元剤を含む溶液との接触時間は、約１２０分または約７．５分とすることができる。

　一局面において、カラムクロマトグラフィーが用いられる場合、抗原結合分子の混合物と還元剤を含む溶液との接触時間は約４分～約１４４０分、約８分～約３００分、約３０分～約２４０分、約６０分～約１８０分、または約１２０分であることができる。特定の態様において、抗原結合分子の混合物と還元剤を含む溶液との接触時間は約１２０分であることができる。

　一局面において、膜クロマトグラフィーが用いられる場合、抗原結合分子の混合物と還元剤を含む溶液との接触時間は約６秒～約６００分、または約１８秒～約１２０分、例えば約７．５分であることができる。

　本開示の方法において、抗原結合分子は、必要に応じて、分析的実験スケール（1～50 mL）、調製スケール（50 mL～10 L）、および製造スケール（10 L以上）等、種々の量で還元剤と接触させることができる。一局面において、基質に担持された抗原結合分子の量は、基質を含有するクロマトグラフィー担体１Ｌあたり約５～１００g、約７～７０ｇ、約１０～４０ｇ、例えば約１０ｇ、または約２５ｇであることができる。

　一局面において、カラムクロマトグラフィーが用いられる場合、基質に担持される抗原結合分子の量は、基質を含有するクロマトグラフィー担体１Ｌあたり、約５ｇ～約８０ｇ、約７ｇ～約７０ｇ、または約１０ｇ～約４０ｇ、例えば約１０ｇであることができる。

　一局面において、膜クロマトグラフィーが用いられる場合、膜に担持される抗原結合分子の量は、膜デバイス体積１Ｌあたり、約５ｇ～約１００ｇ、約７ｇ～約５０ｇ、または約１０ｇ～約４０ｇ、例えば約２５ｇであることができる。

　本開示における方法は、還元剤を除去する工程を含む。本開示において還元剤の除去は、還元剤を完全に取り除くこと、還元剤の濃度を低下させること、還元剤を化学的に不活性化させることを含む。還元剤の除去により、抗原結合分子を構成する2つのFab間のヒンジ領域以外の領域におけるジスルフィド結合の再酸化が促進される。

　一局面において、還元剤の除去は、抗原結合分子と還元剤を含まない溶液とを接触させることにより行うことができる。一局面において、還元剤の除去は、還元剤を含まない溶液をカラムクロマトグラフィーのカラム内または膜クロマトグラフィーのデバイス内に通液させることにより行うことができる。

　いくつかの態様において、還元剤を含まない溶液は、約２秒～約８０分もしくは約３秒～約２４分の通過時間でカラムクロマトグラフィーのカラム内もしくは膜クロマトグラフィーのデバイス内を通液される。特定の態様において、還元剤を含まない溶液は、約４分の通過時間でカラムクロマトグラフィーのカラム内もしくは膜クロマトグラフィーのデバイス内を通液される。いくつかの態様において、通液は、カラム内もしくはデバイス内に該溶液が充填された状態で一時的に停止されてもよい。

　いくつかの態様において、カラムクロマトグラフィーが用いられる場合、還元剤を含まない溶液は、約２分～約８０分、または約４分～約２４分の通過時間でカラム内を通液される。特定の態様において、カラムクロマトグラフィーが用いられる場合、還元剤を含まない溶液は、約４分の通過時間でカラム内を通液される。いくつかの態様において、通液は、カラム内に該溶液が充填された状態で一時的に停止されてもよい。

　いくつかの態様において、カラムクロマトグラフィーが用いられる場合、還元剤を含まない溶液は、約２５ｃｍ／時間～約５００ｃｍ／時間、約５０ｃｍ／時間～約４５０ｃｍ／時間、約２００ｃｍ／時間～約４００ｃｍ／時間、または約２５０ｃｍ／時間～約３５０ｃｍ／時間の速度でカラム内を通液させることができる。また特定の態様において、本開示における還元剤を含まない溶液は、約３００ｃｍ／時間の速度でカラム内を通液させることができる。通液は、カラム内に該溶液が充填された状態で一時的に停止されてもよい。

　いくつかの態様において、膜クロマトグラフィーが用いられる場合、還元剤を含まない溶液は、約２秒～約６０分、または約３秒～約６分、例えば約３０秒の通過時間で膜デバイスを通液される。いくつかの態様において、通液は、デバイス内に該溶液が充填された状態で一時的に停止されてもよい。

　いくつかの態様において、膜クロマトグラフィーが用いられる場合、還元剤を含まない溶液は、約０．０１７ＭＶ／分～約３０ＭＶ／分、約０．１７ＭＶ／分～約２０ＭＶ／分、約１ＭＶ／分～約１０ＭＶ／分、または約２ＭＶ／分～約５ＭＶ／分の速度で膜デバイス内を通液させることができる。また特定の態様において、本開示における還元剤を含まない溶液は、約２ＭＶ／分の速度で膜デバイス内を通液させることができる。通液は、膜デバイス内に該溶液が充填された状態で一時的に停止されてもよい。

　還元剤を含まない溶液も特に限定されるものではないが、一例として緩衝液、より具体的にはリン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酒石酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等、クロマトグラフィー技術において通常用いられる緩衝液を使用することができる。また塩基として、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、Trisなどを例示することができる。一局面において、本開示の方法においては、還元剤を含まない溶液は、還元剤を含まない点を除き接触工程において用いられる還元剤を含む溶液と同じ種類の溶液を使用することができる。

　一局面において、カラムクロマトグラフィーが用いられる場合、還元剤を含まない溶液の通液量は、カラム体積の約０．１倍（約０．１ＣＶ）～約１００倍（約１００ＣＶ）、約１倍（約１ＣＶ）～約２０倍（約２０ＣＶ）、または約３倍（約３ＣＶ）～約１０倍（約１０ＣＶ）であることができる。いくつかの態様において、還元剤を含まない溶液の通液量は、カラム体積の約５．０倍（約５．０ＣＶ）であることができる。

　一局面において、膜クロマトグラフィーが用いられる場合、還元剤を含まない溶液の通液量は、膜デバイスの体積の約１倍（１ＭＶ）～約５００倍（５００ＭＶ）、または約２倍（２ＭＶ）～約１００倍（１００ＭＶ）、例えば約１５倍（１５ＭＶ）であることができる。

　一局面において、抗原結合分子の混合物と還元剤を含まない溶液との反応時間（接触時間）は、約６秒～約１４４０分、約１８秒～約３００分、約５分～約６０分、約１０分～約５０分、または約１２分～約４０分であることができる。特定の態様において、抗原結合分子の混合物と還元剤を含まない溶液との反応時間（接触時間）は、約２０分であることができる。

　一局面において、カラムクロマトグラフィーが用いられる場合、抗原結合分子の混合物と還元剤を含まない溶液との反応時間（接触時間）は、約４分～約１４４０分、約８分～約３００分であることができる。特定の態様において、カラムクロマトグラフィーが用いられる場合、抗原結合分子の混合物と還元剤を含まない溶液との反応時間（接触時間）は、約２０分であることができる。

　一局面において、膜クロマトグラフィーが用いられる場合、抗原結合分子の混合物と還元剤を含まない溶液との反応時間（接触時間）は、約６秒～約６００分、または約１８秒～約１２０分、例えば約７．５分であることができる。

　本発明の方法は、広い温度範囲にわたって実施することができる。例えば、本発明の方法は、約４℃～約３７℃、または約１５℃～約３７℃で実施することができる。抗原結合分子の部分的にまたは完全に精製された調製物を接触させるための典型的な温度は約４℃から約２５℃（周囲温度）、または好ましくは２３℃であるが、より低い温度およびより高い温度でも実施することができる。いくつかの態様において、本開示の方法は、約２０℃から３７℃の温度で、好ましくは２３℃、２５℃、または３７℃で、より好ましくは２３℃で実施することができる。

　還元剤を含まない溶液についても、最適ｐＨは、当業者によって実験的に容易に決定することができる。例えば、約４．５～約１０．０、約５．０～約９．０、約６．５～約８．５、または約７．０～約８．０であることができる。また特定の態様において、最適ｐＨは、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、または約７．９であることができる。

　一局面において、本開示の方法においては、抗原結合分子の混合物と還元剤を含む溶液とを接触させる工程の前に、該混合物とクロマトグラフィー担体とを接触させ、抗原結合分子をカラム内に充填させるまたは膜上に固定させる工程を含むことができる。特定の態様において、混合物が抗原結合分子を含む細胞培養液（Harvested cell culture fluid: HCCF）である場合、細胞培養液と還元剤を含む溶液とを接触させる工程の前に、該細胞培養液とクロマトグラフィー担体とを接触させ、抗原結合分子をカラム内に充填させるまたは膜上に固定させる工程を含むことができる。一局面において、抗原結合分子の混合物は、ヒンジ領域以外の領域に少なくとも１つのジスルフィド結合を有する抗原結合分子（すなわち、LINCフォーマット）、および、ヒンジ領域以外の領域にジスルフィド結合を有さない抗原結合分子（すなわち、unLINCフォーマット）を含む。

　ある局面において、抗原結合分子は、還元剤を含む溶液と接触させる工程の前に、少なくとも部分的に精製されたものであってもよい。いくつかの態様において、本開示における製造方法は、接触させる工程の前に、抗原結合分子を含む細胞培養液をアフィニティクロマトグラフィー（好ましくはプロテインAクロマトグラフィー）に供する工程を含むことができる。

　一局面において、本開示の方法は、接触させる工程の前に、クロマトグラフィー内の不純物を除去する工程を含むことができる。不純物の除去は、一例として実施例に記載されているように、抗原結合分子が吸着された基質を含むカラムに緩衝液を通液させるなど、当業者に周知の方法によって行うことができる。

　一局面において、本開示の方法は、還元剤を除去する工程の前または後に、ヒンジ領域以外の領域に少なくとも１つのジスルフィド結合を有する抗原結合分子を回収もしくは溶出する、および／または当該抗原結合分子を精製する工程さらに含むことができる。一態様において、抗原結合分子の回収および溶出は、溶出バッファーを用いるなど、当業者に周知の方法によって抗原結合分子をクロマトグラフィーカラムから溶出することにより行うことができる。当業者であれば、精製しようとする抗原結合分子の性質に応じて、適宜、溶出バッファーのｐＨや組成などを調整することが可能である。

　一態様において、本明細書において記載されるように製造された抗原結合分子の調製物は、例えば、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティクロマトグラフィー、およびサイズ排除クロマトグラフィー等の当技術分野において公知の技術によって、さらに精製されてもよい。特定の抗原結合分子を精製するために用いられる実際の条件は、正味電荷、疎水性、親水性等の因子に一部依存し、当業者に明らかである。アフィニティクロマトグラフィー精製では、抗原結合分子が結合する、抗体、リガンド、受容体、または抗原を用いることができる。例えば、抗原結合分子のアフィニティクロマトグラフィー精製では、プロテインAまたはプロテインGを有するマトリックスが用いられてもよい。抗原結合分子を単離するために、連続したプロテインAまたはGアフィニティクロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを用いることができる。抗原結合分子の純度は、ゲル電気泳動および高圧液体クロマトグラフィー等を含む、様々な周知の分析方法のいずれかによって決定することができる。

　ある特定の態様において、本明細書に記載の方法によって製造または精製されるヒンジ領域以外の領域に少なくとも１つのジスルフィド結合を有する抗原結合分子は、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、尿素、または塩酸グアニジウム（GuHCl）などのカオトロピック変性剤を利用する分離処理段階でさらに処理されてもよい。検知できるアンフォールディングを観察するためには、相当量のカオトロピック剤が必要とされる。いくつかの態様において、処理段階は、0.1 Mから2 Mの塩酸グアニジンの使用と同等の効果を生じさせる、0.1 Mから2 Mの間のカオトロープを用いる。特定の態様において、酸化的リフォールディングは、およそ1.0 M塩酸グアニジン、または1 M塩酸グアニジンと同じまたは同様の量のリフォールディングを生じさせる量の他のカオトロピック剤の存在下で達成される。いくつかの態様において、約1.5 Mから0.5 Mの間のカオトロープが用いられる。用いられるカオトロピック剤の量は、該カオトロープの存在下での抗原結合分子の構造的安定性に基づく。抗原結合分子のドメイン相互作用の局所的な三次構造および/または四次構造を乱すのに十分だが、分子および/または個々のドメインの二次構造を完全にアンフォールドするのに必要とされるものより少ない、カオトロープを存在させる必要がある。抗原結合分子が平衡変性によってアンフォールドし始めるポイントを決定するために、当業者は、抗原結合分子を含有する溶液にカオトロープを滴定し、円偏光二色性または蛍光などの技術によって構造をモニターし得る。カオトロープの代わりに用いられ得る、抗原結合分子の構造をアンフォールドするかまたはわずかに乱すために用いることができる他のパラメーターが存在する。温度および圧力は、抗原結合分子の構造を変化させるためにこれまでに用いられている2つの基本的パラメーターであり、酸化剤および/または還元剤と接触させる間にカオトロピック剤の代わりに用いられ得る。本発明者らは、抗原結合分子の構造を変性させるまたは乱すことが示されている任意のパラメーターが、カオトロピック剤の代わりに当業者によって用いられ得ることを企図する。

　本開示の方法により、担体に担持された抗原結合分子（すなわち、LINCフォーマットである、ヒンジ領域以外の領域に少なくとも１つのジスルフィド結合を有する抗原結合分子およびunLINCフォーマットの抗原結合分子の合計）に対する、LINCフォーマットの抗原結合分子の割合、すなわち「LINC率」が増加する。LINC率は、例えばWO2021/157679に記載のように、非還元SDS-PAGEによって、架橋したLINCフォーマットと架橋していないunLINCフォーマット（オープン型）を分離させ、それぞれの存在比を比較することにより算出することができる。

　一態様において、本明細書において記載されるように製造された抗原結合分子の調製物は、LINC率を求めるために、例えば、電気泳動法、クロマトグラフィー法等の技術にさらに供されてもよい。すなわち、本開示の方法は、クロマトグラフィーによる精製工程に続いて、精製工程により得られる調製物におけるLINC率、すなわち、(i) ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間で形成される少なくとも１つのジスルフィド結合を有する抗原結合分子（LINC体）、および(ii) 当該抗原結合分子のジスルフィド結合のミスマッチ体および／または形成不全体（unLINC体）の合計に対する、ヒンジ領域以外の領域に少なくとも１つのジスルフィド結合を有する抗原結合分子（LINC体）の割合を定量する工程を含むことができる。特定の態様において、本開示の方法は、(i) ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間で形成される少なくとも１つのジスルフィド結合を有する抗原結合分子（LINC体）、および(ii) 当該抗原結合分子のジスルフィド結合の形成不全体の合計に対する、ヒンジ領域以外の領域に少なくとも１つのジスルフィド結合を有する抗原結合分子（LINC体）の割合を定量する工程を含むことができる。

　一態様において、LINC率を定量化する工程は、電気泳動法、クロマトグラフィー法等を含む。一態様において、電気泳動法として、非還元SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（SDS-PAGE）、非還元キャピラリーSDSゲル電気泳動法（CE-SDS）等を例示することができる。また一態様において、クロマトグラフィー法として、疎水性相互作用クロマトグラフィー法(HIC)等を例示することができる。

　一態様において、本開示の方法は、LINC率を定量する工程の前に、本明細書において記載されるように製造された抗原結合分子の調製物に、プロテアーゼを添加する工程を含んでもよい。一態様において、本開示におけるプロテアーゼは、例えばIgdE、好ましくはStreptococcus agalactiae由来のIgdEであることができる。IgdEは、ヒトIgG1抗体のヒンジ領域上部(KSCDKT / HTCPPCP)を認識するプロテアーゼであり、TとHの間で抗体を消化する酵素である。このような酵素は抗体を分解し、FabとFc領域を生成させることができる。Streptococcus agalactiae由来のIgdEは、文献Spoerry C et al., (2016) PLoS ONE 11(10): e0164809. doi:10.1371/journal.pone.0164809等に開示されている酵素であり、当業者であれば周知技術を用いることにより容易に取得することが可能である。またStreptococcus agalactiae由来のIgdEは、例えばGenovis社より「FabALACTICA^TM(IgdE)」として市販されている。本願発明者らは、本明細書において記載されるように製造された抗原結合分子の調製物にStreptococcus agalactiae由来のIgdEを添加し、IgdEを含む調製物を電気泳動法、クロマトグラフィー法等に供することによって、該調製物におけるLINC率を求めることが可能なことを見出した。

　調製物に添加されるプロテアーゼの濃度は特に限定されるものではないが、一態様において、0.6 - 1.8 Units-enzyme / μg-protein等を例示することができる。

　特定の態様において、本発明の方法が、本明細書において記載されるように製造された抗原結合分子の調製物にプロテアーゼを添加する工程を含む場合、LINC率を定量化する工程において、非還元キャピラリーSDSゲル電気泳動法（CE-SDS）または疎水性相互作用クロマトグラフィー法(HIC)を使用することできる。さらに、特定の態様において、抗原結合分子の調製物を取得するためのクロマトグラフィーは、膜クロマトグラフィーであってもよい。

　一態様において、本開示の方法においては、LINC率を次のように計算することができる。例えば定量化する工程において非還元キャピラリーSDSゲル電気泳動法（CE-SDS）が用いられる場合、プロテアーゼが添加された調製物、プロテアーゼが添加されていない調製物、およびプロテアーゼのみを含む試料についてelectropherogramを調製する。この場合、LINC率は、「unLINC体由来のピークおよびプロテアーゼ由来のピークを含む、プロテアーゼが添加された調製物由来のピークの面積」から、「unLINC体由来のピークを含まない、プロテアーゼが添加されていない調製物由来のピークの面積」および「プロテアーゼのみを含む試料由来のピークの面積」を減じたものに、「LINC体由来のピークの面積」を加えたものに対する、LINC体由来のピークの面積の比率として求められる。なお、プロテアーゼのみを含む試料は、本開示の方法によって得られる抗原結合分子の調製物を含まない点を除き、プロテアーゼが添加された調製物と同一の成分を含むものであることが好ましい。

　異なる一態様において、本開示の方法においては、LINC率を次のように計算することもできる。例えば定量化する工程において疎水性相互作用クロマトグラフィー法(HIC)が用いられる場合、LINC率は、LINC体に由来するピークと全てのunLINC体に由来するピークの合計に対する、LINC体に由来するピークの割合によって求められる。疎水性相互作用クロマトグラフィー法(HIC)における移動相Aおよび移動相Bは、当業者であれば適宜技術常識に基づいて調製することが可能である。またクロマトグラフィー担体も当業者であれば適宜選択することができ、例えば本明細書に記載のものを使用することができる。

　一態様において、本開示の方法は、プロテアーゼを添加した後、調製物を培養する工程をさらに含むことができる。培養条件は特に限定されるものではないが、例えばリン酸緩衝液中、６－８のｐＨで、例えば３７℃で、16～20時間、例えば１８時間インキュベートすることができる。

　なお本開示において、精製のためにクロマトグラフィーに供される抗原結合分子はシグナル配列を含むものであってもよい。特に、ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間に少なくとも１つのジスルフィド結合を形成しうるアミノ酸残基を有する抗原結合分子を細胞で組み換え発現させる場合、発現および／または分泌を容易にするために、抗原結合分子がシグナル配列を有する場合がある。一態様において、抗原結合分子を組み換え発現させるための核酸配列の翻訳産物がシグナル配列を含む場合、本開示の方法は、シグナル配列を抗原結合分子から切断する工程を含むことができる。シグナル配列の切断は、抗原結合分子を精製のためにクロマトグラフィーに供する工程の前または後に、もしくは、クロマトグラフィーによる精製物におけるLINC率を定量する工程の前または後に行うことができる。シグナル配列の切断は、当業者に周知の方法によって行うことができる。

　一局面において、ジスルフィド結合を形成しうるアミノ酸残基は、変異、置換、導入または操作されたシステイン残基である。

　一局面において、ヒンジ領域以外の領域における少なくとも１つのジスルフィド結合は、抗原結合分子を構成するポリペプチド間で形成される。すなわち、特定の態様において、本開示におけるヒンジ領域以外の領域における少なくとも１つのジスルフィド結合は、鎖間ジスルフィド結合である。いくつかの態様において、ヒンジ領域以外の領域における少なくとも１つのジスルフィド結合は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の鎖間ジスルフィド結合である。

　一局面において、ヒンジ領域以外の領域における少なくとも１つのジスルフィド結合は、野生型ＩｇＧには存在しない操作されたジスルフィド結合である。

ＩＩＩ．抗原結合分子
　一局面において、本開示における抗原結合分子は、少なくとも１つのジスルフィド結合を介して互いに連結されることができる第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインを含む。一局面において、本開示の方法により製造または精製される抗原結合分子においては、第一の抗原結合ドメインと第二の抗原結合ドメインとが少なくとも１つのジスルフィド結合を介して連結されている。前記局面の一態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインは、２つ、３つ、４つまたはそれ以上のジスルフィド結合を介して連結されている。

　一態様において、第一および第二の抗原結合ドメインのうちの少なくとも一方は、単体で抗原に結合する活性を有している（すなわち、１つの抗原結合ドメイン単独で抗原結合活性を有する）。特定の態様において、第一および第二の抗原結合ドメインはいずれも、単体で抗原に結合する活性を有している。

　一局面において、本開示における第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのそれぞれは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、またはＶＨＨ構造を有することができる。

　ある局面において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのそれぞれは、Ｆａｂ分子であり、かつ、抗原結合分子は、第一の抗原結合ドメインと第二の抗原結合ドメインとの間に形成される少なくとも１つのジスルフィド結合を含み、好ましくは、少なくとも１つのジスルフィド結合は、ヒンジ領域内にはないアミノ酸残基（システイン）間に、好ましくは、各抗原結合ドメインのＣＨ１領域内のアミノ酸残基（システイン）間に形成される。

　前記局面の一態様において、第一および第二の抗原結合ドメインはいずれもＦａｂおよびヒンジ領域を含む。

　特定の態様において、抗原結合ドメイン間にジスルフィド結合を形成するアミノ酸残基のうちの少なくとも１つは、野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しない変異アミノ酸残基であり、例えば、野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しないシステイン残基である。そのような変異アミノ酸残基は、野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に対して、例えばアミノ酸置換などの手法を用いることにより導入することができる。

　あるいは別の態様において、本開示における抗原結合分子においては、野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在するアミノ酸残基であって、抗原結合ドメイン間のジスルフィド結合に関与し得るアミノ酸残基（例えばシステイン残基）は、他のアミノ酸残基に置換または欠失されてもよい。そのようなシステイン残基として、例えば、ヒンジ領域におけるEUナンバリング220位、226位、229位のシステイン残基、ＣＬ領域における214位のシステイン残基などを挙げることができる。

　前記局面の一態様において、第一および第二の抗原結合ドメインのうちの少なくとも一方は、特定の抗原に結合する抗体断片を含む。特定の態様において、抗体断片は、Fab、Fab’、scFab、Fv、scFv、またはシングルドメイン抗体である。特定の態様において、第一および／または第二の抗原結合ドメインは、ヒンジ領域を含む。ジスルフィド結合を形成するアミノ酸残基はそれぞれ第一および第二の抗原結合ドメインに存在し、抗原結合ドメイン間の結合は、それらのアミノ酸残基の間を連結する形で形成される。特定の態様において、抗原結合ドメイン間でジスルフィド結合を形成するアミノ酸残基のうちの少なくとも１つは、抗体断片内に存在する。

　一局面において、本開示における第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのそれぞれは、ヒンジ領域を含むものであってもよく、またはヒンジ領域を含まないものであってもよい。特定の態様において、本開示における第一および第二の抗原結合ドメインはそれぞれ、Ｆ（ａｂ’）２構造を形成する、Ｆａｂおよびヒンジ領域を含むものであることができる。

　前記局面の一態様において、第一および第二の抗原結合ドメインは、いずれも同じ抗原に結合する。特定の態様において、第一および第二の抗原結合ドメインは、同じ抗原上の同じエピトープに結合する。別の特定の態様において、第一および第二の抗原結合ドメインの各々は、同じ抗原上の異なるエピトープに結合する。特定の態様において、本開示における抗原結合分子は、１種類の特定の抗原を標的とするバイパラトピック（biparatopic）抗原結合分子（例えばバイパラトピック抗体）である。

　前記局面の別の一態様において、第一および第二の抗原結合ドメインの各々は、異なる抗原に結合する。

　前記局面の別の一態様において、本開示における抗原結合分子はクランピング（clamping）抗原結合分子（例えばクランピング抗体）である。本明細書においてクランピング抗原結合分子とは、ある抗原Ａおよび抗原Ａに結合する抗原結合分子から形成される抗原－抗原結合分子複合体に特異的に結合することによって、当該抗原Ａに結合する抗原結合分子の当該抗原Ａに対する結合活性を増加させる（あるいは、当該抗原Ａおよび当該抗原Ａに結合する抗原結合分子から形成される抗原－抗原結合分子複合体を安定化させる）抗原結合分子を意味する。例えば、CD3クランピング抗体は、CD3およびCD3への結合能が低下した抗体（結合減弱CD3抗体）から形成される抗原－抗体複合体に特異的に結合することによって、当該結合減弱CD3抗体のCD3に対する結合活性を増加させる（あるいは、CD3および当該結合減弱CD3抗体から形成される抗原－抗体複合体を安定化させる）ことができる。特定の態様において、本開示における抗原結合分子における第一および／または第二の抗原結合ドメインは、クランピング抗原結合分子に由来する抗原結合ドメイン（クランピング抗原結合ドメイン）であることができる。

　前記局面の一態様において、第一および第二の抗原結合ドメインは、いずれも同じアミノ酸配列を有する。別の一態様において、第一および第二の抗原結合ドメインの各々は、異なるアミノ酸配列を有する。

　前記局面の別の態様において、本開示における抗原結合分子は、２つの抗原分子間での相互作用を制御する活性を有する。特定の理論に拘束されるわけではないが、当該相互作用を制御する活性は、本開示における抗原結合分子が２つの抗原分子を空間的に近接した位置に保持され、可動性が減少する結果としてもたらされるものと考えられる。特定の態様において、本開示における抗原結合分子は、対照となる抗原結合分子に比べて、２つの抗原分子間での相互作用を増強または減弱させることができる。当該対照となる抗原結合分子は、２つの抗原結合ドメイン間のジスルフィド結合の数が１カ所少ないという点でのみ、本開示における抗原結合分子と異なる。さらなる態様において、当該１カ所少ないジスルフィド結合は、野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しない変異アミノ酸残基（例えば、野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しないシステイン残基）に由来する結合の中から選択することができる。当該変異アミノ酸残基は、例えば人工的に変異、置換、導入、または操作されたシステイン残基である。

　一態様において、抗原分子は、サイトカイン受容体スーパーファミリーに属する受容体、Ｇタンパク質結合型受容体、イオンチャネル型受容体、チロシンキナーゼ型受容体、免疫チェックポイント受容体、抗原受容体、ＣＤ抗原、共刺激分子、および細胞接着分子からなる群より選択される。

　特定の態様において、本開示における抗原結合分子が結合する２つの抗原分子は、それぞれリガンドとその受容体であることができる。本開示における抗原結合分子は、当該リガンドによる当該受容体の活性化を促進する活性を有する。別の特定の態様において、本開示における抗原結合分子が結合する２つの抗原分子は、それぞれ酵素とその基質あることができる。本開示における抗原結合分子は、当該酵素の当該基質に対する触媒反応を促進する活性を有する。

　また別の特定の態様において、本開示における抗原結合分子が結合する２つの抗原分子は、ともに細胞表面に存在する抗原（例えばタンパク質）であることができる。本開示における抗原結合分子は、第一の抗原を発現する細胞と第二の抗原を発現する細胞との間での相互作用を促進する活性を有する。例えば、第一の抗原を発現する細胞および第二の抗原を発現する細胞はそれぞれ、細胞傷害活性を有する細胞およびその標的細胞であることができる。本開示における抗原結合分子によって、当該細胞傷害活性を有する細胞による当該標的細胞の損傷が促進される。細胞傷害活性を有する細胞は、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、単球、またはマクロファージである。

　前記局面の一態様において、本開示における抗原結合分子は、プロテアーゼ切断に対して抵抗性を有する。特定の態様において、本開示における抗原結合分子は、対照となる抗原結合分子に比べて、プロテアーゼ切断に対する抵抗性が増大している。特定の態様において、本開示における抗原結合分子は、対照となる抗原結合分子に比べて、プロテアーゼ処理後に残存する全長分子（例えば、全長IgG分子）の割合が増加している。特定の態様において、本開示における抗原結合分子は、対照となる抗原結合分子に比べて、プロテアーゼ処理後に生成される特定の断片（例えば、Fab単量体）の割合が減少している。

　前記局面の一態様において、本開示における抗原結合分子をプロテアーゼで処理した場合、抗原結合ドメインまたはその断片の二量体（例えば、架橋されたFab二量体）が切り出される。一態様において、プロテアーゼは抗原結合分子のヒンジ領域を切断し得る。

　一局面において、本開示における第一および第二の抗原結合ドメインの少なくとも１つは、可溶性タンパク質に結合するものであることができる。他の態様において、本開示における第一および第二の抗原結合ドメインの少なくとも１つは、膜タンパク質に結合するものであることができる。

　本開示における第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインはそれぞれ、第一の抗原および第二の抗原に結合することができる。いくつかの態様において、第一の抗原および第二の抗原は、ヒト、マウス、ラット、サル、ウサギ、またはイヌに由来する。いくつかの態様において、第一の抗原および第二の抗原として、例えば、免疫細胞表面分子（例えば、T細胞表面分子、NK細胞表面分子、樹状細胞表面分子、B細胞表面分子、NKT細胞表面分子、MDSC細胞表面分子、およびマクロファージ表面分子）、または腫瘍細胞、腫瘍血管、および間質細胞等だけでなく、正常組織の上にも発現している抗原（インテグリン、組織因子、VEGFR、PDGFR、EGFR、IGFR、METケモカイン受容体、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、CD44、フィブロネクチン、DR5、TNFRSF等）、サイトカイン受容体スーパーファミリーに属する受容体、Ｇタンパク質結合型受容体、イオンチャネル型受容体、チロシンキナーゼ型受容体、免疫チェックポイント受容体、抗原受容体、ＣＤ抗原、共刺激分子、および細胞接着分子等を例示することができるがこれらに限定されない。

　いくつかの態様において、第一の抗原および第二の抗原のいずれか一方は、例えば、T細胞上に特異的に発現している分子であり、もう一方の抗原は、T細胞または任意の他の免疫細胞の表面上に発現している分子であることができる。第一の抗原および第二の抗原の組み合わせの別の態様において、好ましくは、第一の抗原および第二の抗原のいずれか一方は、例えば、T細胞上に特異的に発現している分子であり、もう一方の抗原は、免疫細胞上に発現している分子であり、かつ予め選択された抗原とは異なっている。

　T細胞上に特異的に発現している分子の具体的な例としては、CD3およびT細胞受容体が挙げられる。特に、CD3が好ましい。例えばヒトCD3の場合には、本開示における抗原結合分子が結合するCD3の部位は、ヒトCD3を構成するγ鎖、δ鎖、またはε鎖の配列中に存在する任意のエピトープであり得る。特に、ヒトCD3複合体中のε鎖の細胞外領域中に存在するエピトープが好ましい。CD3を構成するγ鎖、δ鎖、およびε鎖構造のポリヌクレオチド配列は、NM_000073.2、NM_000732.4、およびNM_000733.3であり、かつそのポリペプチド配列は、NP_000064.1、NP_000723.1、およびNP_000724.1（RefSeq登録番号）である。他の抗原の例としては、Fcγ受容体、TLR、レクチン、IgA、免疫チェックポイント分子、TNFスーパーファミリー分子、TNFRスーパーファミリー分子、およびNK受容体分子が挙げられる。

　1つの態様において、第一の抗原は、T細胞上に特異的に発現している分子、好ましくはCD3などのT細胞受容体複合体分子、より好ましくはヒトCD3であることができる。別の態様において、第二の抗原は、T細胞または任意の他の免疫細胞上に発現している分子、好ましくは免疫細胞上の細胞表面調節因子、より好ましくはT細胞上に発現している共刺激分子、さらにより好ましくはヒトCD137（4-1BB）、CD137L、CD40、CD40L、OX40、OX40L、CD27、CD70、HVEM、LIGHT、RANK、RANKL、CD30、CD153、GITR、およびGITRLを含むがこれに限定されない「TNFスーパーファミリー」または「TNF受容体スーパーファミリー」のタンパク質であることができる。1つの好ましい態様において、第一の抗原はCD3であり、かつ第二の抗原はCD137であることができる。本明細書において、第一の抗原および第二の抗原互換的に定義される。

　特定の態様において、本開示における抗原結合分子は、CD3の部分ペプチドの全体または一部に特異的に結合する。特定の態様において、CD3はヒトCD3またはカニクイザルCD3、最も典型的にはヒトCD3である。特定の態様において、抗原結合分子は、ヒトCD3およびカニクイザルCD3に対して交差反応性である（すなわち、それらに特異的に結合する）。いくつかの態様において、抗原結合分子は、CD3のεサブユニット、特に、配列番号：13（NP_000724.1）（括弧内にRefSeq登録番号を示す）に示されるCD3のヒトCD3εサブユニットに特異的に結合することができる。いくつかの態様において、抗原結合分子は、真核細胞の表面上に発現しているCD3ε鎖に特異的に結合することができる。いくつかの態様において、抗原結合分子は、T細胞の表面上に発現しているCD3ε鎖に結合する。

　特定の態様において、本開示における抗原結合分子は、CD137の部分ペプチドの全体または一部に特異的に結合する。本明細書において用語「CD137」は、4-1BBとも呼ばれ、腫瘍壊死因子（TNF）受容体ファミリーのメンバーである。TNFスーパーファミリーまたはTNF受容体スーパーファミリーに属する因子の例としては、CD137、CD137L、CD40、CD40L、OX40、OX40L、CD27、CD70、HVEM、LIGHT、RANK、RANKL、CD30、CD153、GITR、およびGITRLが挙げられる。

　特定の態様において、CD137はヒトCD137である。いくつかの態様において、本開示における抗原結合分子の好適な例には、以下からなる群より選択される抗体によって結合されるヒトCD137エピトープと同じエピトープに結合する抗原結合分子が含まれる：
　SPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGC配列（配列番号：14）を含む領域を認識する抗体、
　DCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGC配列（配列番号：15）を含む領域を認識する抗体、
　LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAEC配列（配列番号：16）を含む領域を認識する抗体、および
　ヒトCD137タンパク質中のLQDPCSNCPAGTFCDNNRNQIC配列（配列番号：17）を含む領域を認識する抗体。

　前記局面の一態様において、第一および第二の抗原結合ドメインのうちの少なくとも一方は、特定の抗原に結合する非抗体タンパク質またはその断片を含む。特定の態様において、前記非抗体タンパク質は、互いに特異的に結合する一組のリガンドおよび受容体のどちらか一方である。そのような受容体は、例えば、サイトカイン受容体スーパーファミリーに属する受容体、Ｇタンパク質結合型受容体、イオンチャネル型受容体、チロシンキナーゼ型受容体、免疫チェックポイント受容体、抗原受容体、ＣＤ抗原、共刺激分子、および細胞接着分子などを含む。

　一局面において、本開示における抗原結合分子は、第三の抗原結合ドメインをさらに含むものであってもよい。一局面において、第三の抗原結合ドメインは、第一の抗原結合ドメインまたは第二の抗原結合ドメインのいずれか一方に融合されていることができる。

　一局面において、第三の抗原結合ドメインはＦａｂまたはｓｃＦｖであることができる。その場合、第三の抗原結合ドメインは、そのＣ末端で、第一の抗原結合ドメインまたは第二の抗原結合ドメインのいずれか一方のＦａｂ重鎖（ＶＨ領域）のＮ末端に、任意でペプチドリンカーを介して、融合されているものであってもよい。

　特定の態様において、本開示における第一の、第二の、および第三の抗原結合ドメインのそれぞれはＦａｂ分子であることができる。その場合、第三の抗原結合ドメインは、そのＦａｂ重鎖（ＣＨ１領域）のＣ末端で、第一の抗原結合ドメインまたは第二の抗原結合ドメインのいずれか一方のＦａｂ重鎖（ＶＨ領域）のＮ末端に、任意でペプチドリンカーを介して、融合されているものであってもよい。

　一局面において、本開示におけるペプチドリンカーとして、配列番号：18、配列番号：19、および配列番号：20に記載のアミノ酸配列からなる群より選択されるものを例示することができるがこれらに限定されない。

　一局面において、本開示における第三の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖およびＦａｂ重鎖の可変領域が交換されているクロスオーバーＦａｂ分子であり、かつ第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのそれぞれが従来型のＦａｂ分子であることができる。

　一局面において、本開示における第三の抗原結合ドメインは、上述の第一の抗原および第二の抗原とは異なる第三の抗原に結合することができる。第三の抗原に結合する第三の抗原結合ドメインは、任意の抗原を認識する抗原結合ドメインであり得る。本開示における第三の抗原に結合する第三の抗原結合ドメインは、がん細胞またはがん組織において特異的に発現している分子を認識する抗原結合ドメインであり得る。

　いくつかの態様において、第三の抗原は、ヒト、マウス、ラット、サル、ウサギ、またはイヌに由来する。いくつかの態様において、第三の抗原は、ヒト、マウス、ラット、サル、ウサギ、またはイヌに由来する細胞または器官上に特異的に発現している分子である。第三の抗原は好ましくは、細胞または器官上に全身的に発現していない分子である。第三の抗原は好ましくは、例えば腫瘍細胞特異的抗原であり、これらには、細胞の悪性化に付随して発現する抗原、ならびに細胞の悪性形質転換時に細胞表面またはタンパク質分子上に現れる異常な糖鎖も含まれる。その具体例としては、ALK受容体（プレイオトロフィン受容体）、プレイオトロフィン、KS 1/4膵臓がん抗原、卵巣がん抗原（CA125）、前立腺酸性リン酸（prostatic acid phosphate）、前立腺特異的抗原（PSA）、黒色腫関連抗原p97、黒色腫抗原gp75、高分子量黒色腫抗原（HMW-MAA）、前立腺特異的膜抗原、がん胎児性抗原（CEA）、多型上皮ムチン抗原、ヒト乳脂肪球抗原、結腸直腸腫瘍関連抗原（例えば、CEA、TAG-72、CO17-1A、GICA 19-9、CTA-1、およびLEA）、バーキットリンパ腫抗原 38.13、CD19、ヒトBリンパ腫抗原 CD20、CD33、黒色腫特異的抗原（例えば、ガングリオシドGD2、ガングリオシドGD3、ガングリオシドGM2、およびガングリオシドGM3）、腫瘍特異的移植抗原（TSTA）、T抗原、ウイルスにより誘導される腫瘍抗原（例えばDNA腫瘍ウイルスおよびRNA腫瘍ウイルスのエンベロープ抗原）、結腸CEA、がん胎児性抗原α-フェトプロテイン（例えば、がん胎児性栄養膜糖タンパク質 5T4およびがん胎児性膀胱腫瘍抗原）、分化抗原（例えば、ヒト肺がん抗原L6およびL20）、線維肉腫抗原、ヒトT細胞白血病関連抗原 Gp37、新生糖タンパク質、スフィンゴ脂質、乳がん抗原（例えば、EGFR（上皮成長因子受容体））、NY-BR-16、NY-BR-16およびHER2抗原（p185HER2）、多型上皮ムチン（PEM）、悪性ヒトリンパ球抗原 APO-1、分化抗原例えば、胎児赤血球に認められるI抗原、成人赤血球に認められる初期内胚葉I抗原、移植の前の胚または胃がんに認められるI（Ma）、乳腺上皮に認められるM18、M39、骨髄細胞に認められるSSEA-1、VEP8、VEP9、Myl、VIM-D5、結腸直腸がんに認められるD156-22、TRA-1-85（血液型H）、精巣および卵巣がんに認められるSCP-1、結腸がんに認められるC14、肺がんに認められるF3、胃がんに認められるAH6、Yハプテン、胚性がん細胞に認められるLey、TL5（血液型A）、A431細胞に認められるEGF受容体、膵臓がんに認められるE1シリーズ（血液型B）、胚性がん細胞に認められるFC10.2、胃がん抗原、腺がんに認められるCO-514（血液型Lea）、腺がんに認められるNS-10、CO-43（血液型Leb）、A431細胞のEGF受容体に認められるG49、結腸がんに認められるMH2（血液型ALeb/Ley）、結腸がんに認められる19.9、胃がんムチン、骨髄細胞に認められるT5A7、黒色腫に認められるR24、胚性がん細胞に認められる4.2、GD3、D1.1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2、およびM1:22:25:8、4細胞期～8細胞期の胚に認められるSSEA-3およびSSEA-4、皮膚T細胞リンパ腫関連抗原、MART-1抗原、シアリルTn（STn）抗原、結腸がん抗原NY-CO-45、肺がん抗原NY-LU-12バリアントA、腺がん抗原 ART1、腫瘍随伴性関連脳-精巣がん抗原（腫瘍神経抗原 MA2および腫瘍随伴性神経抗原）、神経腫瘍学的腹側（neuro-oncological ventral）抗原 2（NOVA2）、血液細胞がん抗原遺伝子520、腫瘍関連抗原 CO-029、腫瘍関連抗原 MAGE-C1（がん/精巣抗原 CT7）、MAGE-B1（MAGE-XP抗原）、MAGE-B2（DAM6）、MAGE-2、MAGE-4a、MAGE-4b MAGE-X2、がん-精巣抗原（NY-EOS-1）、YKL-40、ならびにこれらのポリペプチドの任意の断片、ならびにその改変された構造（前述の改変されたリン酸基、糖鎖等）、EpCAM、EREG、CA19-9、CA15-3、シアリルSSEA-1（SLX）、HER2、PSMA、CEA、ならびにCLEC12Aが挙げられる。

　1つの好ましい態様において、第三の抗原はグリピカン-3（GPC3）である。さらに別の態様において、第三の抗原はDLL3（デルタ様3）である。特定の態様において、第三の抗原結合ドメインは、DLL3に結合する「DLL3抗原結合ドメイン」であることができる。

　用語「DLL3」は、本明細書において用いる場合、別段の指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト）およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物供給源由来の任意の天然型 DLL3（デルタ様3）を指す。該用語は、プロセシングを受けていない「全長」のDLL3ならびに細胞でのプロセシングによって生じる任意の形態のDLL3を包含する。該用語はまた、DLL3の天然に生じるバリアント、例えば、スプライスバリアントまたは対立遺伝子バリアントも包含する。例示的なヒトDLL3のアミノ酸配列はNCBI参照配列（RefSeq）NM_016941.3として公知であり、例示的なカニクイザルDLL3のアミノ酸配列はNCBI参照配列XP_005589253.1として公知であり、例示的なマウスDLL3のアミノ酸配列はNCBI参照配列NM_007866.2として公知である。

　ヒトDLL3タンパク質は、C末端側に膜貫通（TM）領域および細胞内ドメイン、ならびにN末端側にDSL（Notch）ドメインを含む。加えて、DLL3は、N末端側からC末端側へ6つの領域、EGF1からEGF6を含むEGFドメインを有する。

　いくつかの態様において、DLL3抗原結合ドメインは、DLL3の細胞外ドメインに特異的に結合する。いくつかの態様において、DLL3抗原結合ドメインは、DLL3の細胞外ドメイン内のエピトープに特異的に結合する。いくつかの態様において、DLL3抗原結合ドメインは、真核細胞の表面上に発現しているDLL3タンパク質に結合する。いくつかの態様において、DLL3抗原結合ドメインは、がん細胞の表面上に発現しているDLL3タンパク質に結合する。

　いくつかの態様において、本開示におけるDLL3抗原結合ドメインは、細胞外ドメイン（ECD）内、すなわち、N末端からTM領域の直前までだが、TM領域またはC末端細胞内ドメインまでではないドメイン内のエピトープに結合する。本開示におけるDLL3抗原結合ドメインは、ECD内の上述のドメイン/領域のいずれか内のエピトープに結合し得る。好ましい態様において、本開示におけるDLL3抗原結合ドメインは、EGF6からTM領域の直前までの領域内のエピトープに結合する。より具体的には、本開示におけるDLL3抗原結合ドメインは、ヒトDLL3における配列番号：21で定義される領域内のエピトープに結合し得る。いくつかの態様において、本開示におけるDLL3抗原結合ドメインは、ヒトDLL3のEGF1、EGF2、EGF3、EGF4、EGF5、もしくはEGF6領域、またはEGF6からTM領域の直前までの領域、またはヒトDLL3のEGF1、EGF2、EGF3、EGF4、EGF5、もしくはEGF6領域、またはEGF6からTM領域の直前までの領域内のエピトープに結合する。いくつかの態様において、抗原結合分子またはDLL3抗原結合ドメインは、結合されるDLL3エピトープが特性解析されているこれまでの報告された抗DLL3抗体（例えば、WO2019131988およびWO2011093097）に由来し得る。

　ヒトDLL3では、上述のドメイン/領域は、以下のアミノ酸残基（例えば、www.uniprot.org/uniprot/Q9NYJ7またはWO2013/126746を参照）：
細胞外ドメイン（ECD）:1位から492位にあるアミノ酸残基；
DSLドメイン:176位から215位にあるアミノ酸残基；
EGFドメイン:216位から465位にあるアミノ酸残基；
EGF1領域:216位から249位にあるアミノ酸残基；
EGF2領域:274位から310位にあるアミノ酸残基；
EGF3領域:312位から351位にあるアミノ酸残基；
EGF4領域:353位から389位にあるアミノ酸残基；
EGF5領域:391位から427位にあるアミノ酸残基；
EGF6領域:429位から465位にあるアミノ酸残基；
EGF6からTM領域の直前までの領域: 429位から492位にあるアミノ酸残基；
TM領域:493位から513位にあるアミノ酸残基；および
C末端細胞内ドメイン: 516位から618位（または一部のアイソフォームでは516位から587位）にあるアミノ酸残基
を有する。上記に記述されるアミノ酸位置はまた、配列番号：22に示されるアミノ酸配列におけるアミノ酸位置も指す。

　したがって、本開示における抗原結合分子は、ヒトDLL3における上述の位置にあるアミノ酸残基を有する上述の領域/ドメインに結合し得る。すなわち、本開示における抗原結合分子は、ヒトDLL3における上述の位置にあるアミノ酸残基を有する上述の領域/ドメイン内のエピトープに結合し得る。

　本開示において用いられるDLL3タンパク質は、その起源によって限定されず、好ましくはヒトまたはカニクイザルDLL3タンパク質である。

　いくつかの態様において、DLL3タンパク質として、DLL3 ECD断片タンパク質（またはECDバリアント）が用いられ得る。切断の部位に応じて、断片/バリアントは、N末端側からC末端側へ、DSLドメインからEGF6、EGF1からEGF6、EGF2からEGF6、EGF3からEGF6、EGF4からEGF6、EGF5およびEGF6、またはEGF6を含んでもよい。断片/バリアントは、EGF6領域の直後からTM領域の直前までに及ぶ領域をさらに含んでもよい。Flagタグを、当技術分野において周知の技術を用いて断片/バリアントのC末端に付着させてもよい。

　本開示におけるCD3、CD137、またはDLL3タンパク質は、上記に記載される配列を有するタンパク質であってもよく、または1つまたは複数のアミノ酸の改変によって上記に記載される配列から導き出される配列を有する改変タンパク質であってもよい。1つまたは複数のアミノ酸の改変によって上記に記載される配列から導き出される配列を有する改変タンパク質の例としては、上記に記載されるアミノ酸配列に対して、70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、さらにより好ましくは95％以上の同一性を有するポリペプチドを挙げることができる。あるいは、これらのCD3、CD137、またはDLL3タンパク質の部分ペプチドが用いられてもよい。

　特定の態様において、本明細書において記載される抗原結合分子は、異なる種のCD3、CD137、またはDLL3の間で保存されているCD3、CD137、またはDLL3のエピトープに結合する。特定の態様において、本開示における抗原結合分子は、三重特異性抗原結合分子、すなわち、3種類の異なる抗原に特異的に結合することができる、つまり、CD3またはCD137のいずれか一方に結合することができるが、両方の抗原に同時には結合せず、かつDLL3に特異的に結合することができる、三重特異性抗原結合分子である。

　ある局面において、第三の抗原結合ドメインは従来型のFabであり、かつ
　（a）第1のポリペプチドは、（N末端からC末端へ）第三の抗原結合ドメインのVH、重鎖定常領域（CH1）；および第1の抗原結合ドメインのVH、重鎖定常領域（CH1）；および任意でヒンジ領域および/またはFc領域（CH2およびCH3）を含み；
　（b）第2のポリペプチドは、（N末端からC末端へ）第三の抗原結合ドメインのVL、および軽鎖定常領域（CL）を含み；
　（c）第3のポリペプチドは、（N末端からC末端へ）第二の抗原結合ドメインのVH、重鎖定常領域（CH1）；および任意でヒンジ領域および/またはFc領域（CH2およびCH3）を含み；
　（d）第4のポリペプチドは、（N末端からC末端へ）第二の抗原結合ドメインのVL、および軽鎖定常領域（CL）を含み；かつ
　（e）第5のポリペプチドは、（N末端からC末端へ）第一の抗原結合ドメインのVL、および軽鎖定常領域（CL）を含む。

　ある局面において、第三の抗原結合ドメインは、（Fab軽鎖およびFab重鎖の可変領域が交換されている）VH/VLクロスオーバーFabであり、かつ
　（a）第1のポリペプチドは、（N末端からC末端へ）第三の抗原結合ドメインのVL、重鎖定常領域（CH1）；および第1の抗原結合ドメインのVH、重鎖定常領域（CH1）；および任意でヒンジ領域および/またはFc領域（CH2およびCH3）を含み；
　（b）第2のポリペプチドは、（N末端からC末端へ）第三の抗原結合ドメインのVH、および軽鎖定常領域（CL）を含み；
　（c）第3のポリペプチドは、（N末端からC末端へ）第二の抗原結合ドメインのVH、重鎖定常領域（CH1）；および任意でヒンジ領域および/またはFc領域（CH2およびCH3）を含み；
　（d）第4のポリペプチドは、（N末端からC末端へ）第二の抗原結合ドメインのVL、および軽鎖定常領域（CL）を含み；かつ
　（e）第5のポリペプチドは、（N末端からC末端へ）第一の抗原結合ドメインのVL、および軽鎖定常領域（CL）を含む。

　一局面において、本開示における抗原結合分子はＦｃ領域をさらに含むものであることができる。一局面においてＦｃ領域は、安定な会合が可能な第１のおよび第２のＦｃ領域サブユニットで構成される。

　一局面において、本開示における抗原結合分子においては、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのそれぞれがＦａｂであり、第一の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃ領域の第１のまたは第２のサブユニットのいずれか一方のＮ末端に融合され、かつ第二の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃ領域の他方のサブユニットのＮ末端に融合されている。

　一局面において、本開示におけるＦｃ領域はヒト由来であることができる。いくつかの態様において、本開示におけるＦｃ領域は、ＩｇＧＦｃ領域、好ましくはヒトＩｇＧＦｃ領域、より好ましくはヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域であることができる。

　ある特定の態様において、抗原結合分子のFc領域は、安定な会合が可能な第1のおよび第2のFc領域サブユニットで構成され、かつFc領域は、天然型ヒトIgG1 Fc領域と比較して、ヒトFcγ受容体に対して低下した結合アフィニティを示す。

　ある特定の態様において、本明細書において記載される抗原結合分子のFc領域は、Fc領域の第1のおよび第2のサブユニットの会合を促進する改変を含む。特定の態様において、該改変は、Fc領域の2つのサブユニットの一方に「ノブ（knob）」改変およびFc領域の2つのサブユニットのもう一方に「ホール（hole）」改変を含む、いわゆる「knob-into-hole」改変であり、以下においてより詳細に記載される。

　knob-into-holeテクノロジーは、例えば、米国特許第5,731,168号；米国特許第7,695,936号；Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996)；およびCarter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)に記載されている。一般に、方法は、突起（「knob」）が空隙（「hole」）中に位置し、ヘテロ二量体の形成を促進しかつホモ二量体の形成を妨げることができるように、突起を第1のポリペプチドの界面に、および対応する空隙を第2のポリペプチドの界面に導入する段階を伴う。突起は、第1のポリペプチドの界面の小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置き換えることによって構築される。突起と同じまたは同様のサイズの補償的な空隙は、大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの（例えば、アラニンまたはスレオニン）で置き換えることによって第2のポリペプチドの界面に作出される。

　したがって、特定の態様においては、抗原結合分子のFcドメインの第1のサブユニットのCH3ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それによって、第2のサブユニットのCH3ドメイン内の空隙中に位置することができる第1のサブユニットのCH3ドメイン内の突起が生成され、Fcドメインの第2のサブユニットのCH3ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それによって、第1のサブユニットのCH3ドメイン内の突起が位置することができる第2のサブユニットのCH3ドメイン内の空隙が生成される。

　突起および空隙は、ポリペプチドをコードする核酸を例えば部位特異的変異誘発によって変更することによって、またはペプチド合成によって、作ることができる。

　特定の態様において、Fcドメインの第1のサブユニットのCH3ドメインにおいて、366位のスレオニン残基は、トリプトファン残基で置き換えられ（T366W）、Fcドメインの第2のサブユニットのCH3ドメインにおいて、407位のチロシン残基は、バリン残基で置き換えられる（Y407V）。1つの態様において、Fcドメインの第2のサブユニットにおいて、さらに、366位のスレオニン残基は、セリン残基で置き換えられ（T366S）、368位のロイシン残基は、アラニン残基で置き換えられる（L368A）。

　なおさらなる態様において、Fcドメインの第1のサブユニットにおいて、さらに、354位のセリン残基は、システイン残基で置き換えられ（S354C）、Fcドメインの第2のサブユニットにおいて、さらに、349位のチロシン残基は、システイン残基によって置き換えられる（Y349C）。これらの2つのシステイン残基の導入は、Fcドメインの2つのサブユニット間にジスルフィド架橋の形成をもたらし、二量体をさらに安定化する（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。

　特定の態様において、安定な会合が可能な第1のおよび第2のFc領域サブユニットで構成され、かつ天然型ヒトIgG1 Fc領域と比較してヒトFcγ受容体に対して低下した結合アフィニティを示す、Fc領域において、第1のFc領域サブユニットは、以下：
　（a1）変異L234A、L235Aを含むFc領域ポリペプチド；
　（a2）変異L234A、L235A、N297Aを含むFc領域ポリペプチド；および
　（a3）変異L234A、L235A、N297A、S354C、T366Wを含むFc領域ポリペプチド
からなる群より選択され、かつ
第2のFc領域ポリペプチドは、以下：
　（a4）変異L234A、L235Aを含むFc領域ポリペプチド；
　（a5）変異L234A、L235A、N297Aを含むFc領域ポリペプチド；および
　（a6）変異L234A、L235A、N297A、Y349C、T366S、L368A、Y407Vを含むFc領域ポリペプチド
からなる群より選択される（アミノ酸位置はEUインデックスナンバリングを用いてナンバリングされる）。

　ある特定の態様において、本明細書において記載される抗原結合分子のFc領域は、天然型 IgGのFc領域のものと比較して酸性pH条件（例えば、pH 5.8）下で増強されたFcRn結合活性を示す。そのようなFc領域は、例えば、EUナンバリングによる、434位にAla；438位にGlu、Arg、Ser、またはLys；および440位にGlu、Asp、またはGlnを含む。

　いくつかの態様において、Fc領域は、EUナンバリングによる、434位にAla；438位にArgまたはLys；および440位にGluまたはAspを含む。

　いくつかの態様において、Fc領域は、EUナンバリングによる、428位にIleもしくはLeu；および/または 436位にIle、Leu、Val、Thr、もしくはPheをさらに含む。

　いくつかの態様において、Fc領域は、EUナンバリングによる、以下：
　（a）N434A/Q438R/S440E；
　（b）N434A/Q438R/S440D；
　（c）N434A/Q438K/S440E；
　（d）N434A/Q438K/S440D；
　（e）N434A/Y436T/Q438R/S440E；
　（f）N434A/Y436T/Q438R/S440D；
　（g）N434A/Y436T/Q438K/S440E；
　（h）N434A/Y436T/Q438K/S440D；
　（i）N434A/Y436V/Q438R/S440E；
　（j）N434A/Y436V/Q438R/S440D；
　（k）N434A/Y436V/Q438K/S440E；
　（l）N434A/Y436V/Q438K/S440D；
　（m）N434A/R435H/F436T/Q438R/S440E；
　（n）N434A/R435H/F436T/Q438R/S440D；
　（o）N434A/R435H/F436T/Q438K/S440E；
　（p）N434A/R435H/F436T/Q438K/S440D；
　（q）N434A/R435H/F436V/Q438R/S440E；
　（r）N434A/R435H/F436V/Q438R/S440D；
　（s）N434A/R435H/F436V/Q438K/S440E；
　（t）N434A/R435H/F436V/Q438K/S440D；
　（u）M428L/N434A/Q438R/S440E；
　（v）M428L/N434A/Q438R/S440D；
　（w）M428L/N434A/Q438K/S440E；
　（x）M428L/N434A/Q438K/S440D；
　（y）M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E；
　（z）M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440D；
　（aa）M428L/N434A/Y436T/Q438K/S440E；
　（ab）M428L/N434A/Y436T/Q438K/S440D；
　（ac）M428L/N434A/Y436V/Q438R/S440E；
　（ad）M428L/N434A/Y436V/Q438R/S440D；
　（ae）M428L/N434A/Y436V/Q438K/S440E；
　（af）M428L/N434A/Y436V/Q438K/S440D；
　（ag）L235R/G236R/S239K/M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E；および
　（ah）L235R/G236R/A327G/A330S/P331S/M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E
からなる群より選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含む。

　いくつかの態様において、抗原結合分子のFc領域は、M428L/N434A/Q438R/S440Eのアミノ酸置換の組み合わせを含む。

　一局面において、本開示におけるＦｃ領域は、Ｆｃ領域の多量体化を促進する１つ以上のアミノ酸置換の組み合わせを含むものであってもよい。多量体化を促進するアミノ酸置換として、ＥＵナンバリング２４７位、２４８位、２５３位、２５４位、３１０位、３１１位、３３８位、３４５位、３５６位、３５９位、３８２位、３８５位、３８６位、４３０位、４３３位、４３４位、４３６位、４３７位、４３８位、４３９位、４４０位、および４４７位からなる群より選択される少なくとも１つの部位におけるアミノ酸置換が挙げられる（例えばWO2016/164480などを参照）。特定の態様において、多量体として二量体、三量体、および四量体が挙げられるがこれらに限定されない。

　一局面において、本開示における抗原結合分子は、そのヒンジ領域内において、システイン残基のうちの少なくとも１つが置換されたアミノ酸残基を有するものであってもよい。いくつかの態様において、当該システイン残基は、ヒンジ領域のＥＵナンバリング２２６位および／または２２９位に存在することができる。

　ある態様において、Fc領域は、以下：
　（a）配列番号：23に示されるアミノ酸配列を含む第1のFcサブユニットおよび配列番号：24に示されるアミノ酸配列を含む第2のFcサブユニット、
　（b）配列番号：25に示されるアミノ酸配列を含む第1のFcサブユニットおよび配列番号：26に示されるアミノ酸配列を含む第2のFcサブユニット、または
　（c）配列番号：58に示されるアミノ酸配列を含む第1のFc領域サブユニットおよび配列番号：59に示されるアミノ酸配列を含む第2のFc領域サブユニット
のいずれかを含む。

　一局面において、本開示における抗原結合分子は多重特異性抗原結合分子である。いくつかの態様において、多重特異性抗原結合分子は二重特異性抗原結合分子または三重特異性抗原結合分子である。

　一局面において、本開示における抗原結合分子は抗体である。特定の態様において、本開示における抗体はＩｇＧ抗体、好ましくはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体である。

ＩＶ．ジスルフィド結合
　本開示において、ヒンジ領域以外の領域における少なくとも1つのジスルフィド結合は、略語「LINC」で記載される場合がある。この略語を用いると、いくつかの態様において、本開示における抗原結合分子は、例えば、「Dual/LINC」、「DLL3-Dual/LINC」、または「対をなすシステイン形態」等として表示され得る。少なくとも1つのジスルフィド結合を介して第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインが連結されない/まだ連結されていない抗原結合分子は、略語「unLINC」または「対をなさないシステインを有するDual-LINC-Ig」等で記載され得る。

　本発明の1つの局面において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのそれぞれは、ヒンジ領域以外の領域において少なくとも1つのシステイン残基を（変異、置換、または挿入を介して）含む。本開示における「LINC」抗原結合分子においては、該少なくとも1つのシステイン残基は、第一の抗原結合ドメインと第二の抗原結合ドメインとの間に少なくとも1つのジスルフィド結合を形成する。

　上記局面のある態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインを連結する少なくとも1つのジスルフィド結合は、2つの抗原結合ドメイン（すなわち、上記に記載されるような第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメイン）を空間的に近い位置に保持することができる。ジスルフィド結合を介する第一の抗原結合ドメインと第二の抗原結合ドメインとの間の連結のために、本開示における抗原結合分子は、2つの抗原結合ドメイン間に導入された追加の結合を有さないという点でのみ本開示における抗原結合分子と相違する対照抗原結合分子より近い位置で、2つの抗原結合分子を保持することができる。いくつかの態様において、用語「空間的に近い位置」または「より近い位置」には、上記に記載される第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインが、短縮された距離および/または低下した可動性で保持されるという意味が含まれる。

　結果として、本開示における抗原結合分子の2つの抗原結合ドメイン（すなわち、上記に記載されているような第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメイン）は、同じ単一の細胞上に発現している抗原に結合することができる。換言すると、本開示における抗原結合分子の2つの抗原結合ドメイン（すなわち、上記に記載されるような第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメイン）の各々は、異なる細胞の架橋をもたらすように、異なる細胞上に発現している抗原に結合しない。本開示における抗原結合分子のそのような抗原結合様式は「シス結合」と呼ぶことができ、これに対して、抗原結合分子の2つの抗原結合ドメインの各々が、異なる細胞上に発現している抗原に結合して、異なる細胞の架橋をもたらす、抗原結合分子の抗原結合様式は、「トランス結合」と呼ぶことができる。いくつかの態様において、本開示における抗原結合分子は主に、「シス結合」様式で同じ単一の細胞上に発現している抗原に結合する。

　上記局面のある態様において、上記に記載されるようなジスルフィド結合を介する第一の抗原結合ドメインと第二の抗原結合ドメインとの間のジスルフィド結合のために、本開示における抗原結合分子は、免疫細胞（例えば、T細胞、NK細胞、またはDC細胞等）の望ましくない架橋形成および活性化を低下させるおよび/または妨げることができる。すなわち、いくつかの態様において、本開示における抗原結合分子の第一の抗原結合ドメインは、T細胞などの免疫細胞上に発現している任意シグナル伝達分子（例えば、第1の抗原）に結合し、本開示における抗原結合分子の第二の抗原結合ドメインもまた、T細胞などの免疫細胞上に発現している任意のシグナル伝達分子（例えば、第1の抗原、または第1の抗原とは異なる第2の抗原）に結合する。したがって、本開示における抗原結合分子の第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインは、同じ単一の免疫細胞、例えばT細胞上（すなわち、シス結合様式）または異なる免疫細胞、例えばT細胞上（すなわち、トランス結合様式）に発現している第一のまたは第2のシグナル伝達分子のいずれかに結合できる。第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインが、トランス結合様式で異なる免疫細胞、例えばT細胞上に発現しているシグナル伝達分子に結合する場合、それらの異なる免疫細胞、例えばT細胞は架橋され、ある特定の状況において、T細胞などの免疫細胞のそのような架橋形成は、T細胞などの免疫細胞の望ましくない活性化を引き起こし得る。

　一方、本開示における抗原結合分子の別の態様の場合において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインはどちらも、「シス結合」様式で同じ単一の免疫細胞、例えばT細胞上に発現しているシグナル伝達分子に結合することができ、これにより、抗原結合分子を介する異なる免疫細胞、例えばT細胞の架橋形成が低減して、免疫細胞の望ましくない活性化を回避できる。

　一局面において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインを連結する少なくとも１つのジスルフィド結合は、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインにおけるそれぞれ同じ位置に存在するアミノ酸残基を互いに連結させることによって形成されてもよく、またはそれぞれ異なる位置に存在するアミノ酸残基を互いに連結させることによって形成されてもよい。

　抗原結合ドメインにおけるアミノ酸残基の位置は、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD 1991 に記載のKabatナンバリングまたはEUナンバリングシステム（EUインデックスとも呼ばれる）にしたがって示すことができる。例えば、第一および第二の抗原結合ドメイン間でのジスルフィド結合の形成に関与するアミノ酸残基が、各抗原結合ドメインにおける対応する同じ位置に存在する場合、それらのアミノ酸残基の位置は、KabatナンバリングまたはEUナンバリングシステムにしたがって同じ番号で示すことができる。あるいは、第一および第二の抗原結合ドメイン間でのジスルフィド結合の形成に関与するアミノ酸残基が、各抗原結合ドメインにおける対応しない異なる位置に存在する場合、それらのアミノ酸残基の位置は、KabatナンバリングまたはEUナンバリングシステムにしたがって異なる番号で示すことができる。

　一局面において、抗原結合ドメイン間のジスルフィド結合の起点となるアミノ酸残基は、第一および第二の抗原結合ドメインにそれぞれ存在し、それらの抗原結合ドメイン間の結合は、これらのアミノ酸残基を連結する形で形成される。前記局面の一態様において、抗原結合ドメイン間のジスルフィド結合の起点となるアミノ酸残基のうち少なくとも１つは、人工的に変異、置換、導入、または操作された変異アミノ酸残基であり、例えば、人工的に導入されたシステイン残基である。そのような変異アミノ酸残基は、野生型の抗原結合ドメインに対して、例えばアミノ酸置換などの手法を用いることにより導入することができる。いくつかの態様において、少なくとも１つのジスルフィド結合は、第一の抗原結合ドメインの重鎖おけるアミノ酸残基と第二の抗原結合ドメインの重鎖におけるアミノ酸残基との間、または、第一の抗原結合ドメインの軽鎖におけるアミノ酸残基と第二の抗原結合ドメインの軽鎖におけるアミノ酸残基との間で形成される。更なる態様において、第一の抗原結合ドメインにおけるＣＨ１領域、ＣＬ領域、ＶＨ領域、ＶＬ領域、およびＶＨＨ領域と第二の抗原結合ドメインにおけるＣＨ１領域、ＣＬ領域、ＶＨ領域、ＶＬ領域、およびＶＨＨ領域の任意の組み合わせにおけるアミノ酸残基間で形成される。

　一局面において、少なくとも１つのジスルフィド結合は、第一の抗原結合ドメインのＣＨ１領域おけるアミノ酸残基と第二の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるアミノ酸残基との間で形成される。特定の態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインにおけるアミノ酸残基はそれぞれ、例えば、ＣＨ１領域のＥＵナンバリング１１９位から１２３位、１３１位から１４０位、１４８位から１５０位、１５５位から１６７位、１７４位から１７８位、１８８位から１９７位、２０１位から２１４位、２１８位から２１９位のいずれかに存在する。特定の態様において、当該アミノ酸残基は、ＣＨ１領域のＥＵナンバリング１１９位、１２２位、１２３位、１３１位、１３２位、１３３位、１３４位、１３５位、１３６位、１３７位、１３８位、１３９位、１４０位、１４８位、１５０位、１５５位、１５６位、１５７位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１６４位、１６５位、１６７位、１７４位、１７６位、１７７位、１７８位、１８８位、１８９位、１９０位、１９１位、１９２位、１９３位、１９４位、１９５位、１９６位、１９７位、２０１位、２０３位、２０５位、２０６位、２０７位、２０８位、２１１位、２１２位、２１３位、２１４位、２１８位、および２１９位からなる群より選択されるいずれかに存在する。特定の態様において、当該アミノ酸残基は、ＣＨ１領域のＥＵナンバリング１３４位、１３５位、１３６位、１３７位、１９１位、１９２位、１９３位、１９４位、１９５位、または１９６位に存在する。特定の態様において、当該アミノ酸残基は、ＣＨ１領域のＥＵナンバリング１３５位、１３６位、または１９１位に存在する。

　前記局面の一態様において、少なくとも１つのジスルフィド結合は、第一の抗原結合ドメインのＣＨ１領域おけるアミノ酸残基と第二の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるアミノ酸残基との間で形成される。特定の態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインにおけるアミノ酸残基はそれぞれ、EUナンバリング119位、120位、121位、122位、および123位からなる群より独立して選択される。特定の態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインにおけるアミノ酸残基はそれぞれ、EUナンバリング131位、132位、133位、134位、135位、136位、137位、138位、139位、および140位からなる群より独立して選択される。特定の態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインにおけるアミノ酸残基はそれぞれ、EUナンバリング148位、149位、および150位からなる群より独立して選択される。特定の態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインにおけるアミノ酸残基はそれぞれ、EUナンバリング155位、156位、157位、158位、159位、160位、161位、162位、163位、164位、165位、166位、および167位からなる群より独立して選択される。特定の態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインにおけるアミノ酸残基はそれぞれ、EUナンバリング174位、175位、176位、177位、および178位からなる群より独立して選択される。特定の態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインにおけるアミノ酸残基はそれぞれ、EUナンバリング188位、189位、190位、191位、192位、193位、194位、195位、196位、および197位からなる群より独立して選択される。特定の態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインにおけるアミノ酸残基はそれぞれ、EUナンバリング201位、202位、203位、204位、205位、206位、207位、208位、209位、210位、211位、212位、213位、および214位からなる群より独立して選択される。特定の態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインにおけるアミノ酸残基はそれぞれ、EUナンバリング218位および219位からなる群より独立して選択される。

　前記局面の一態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインにおいてそれぞれジスルフィド結合を形成するアミノ酸残基の位置の差（すなわちそれらの間の距離）は、３アミノ酸以内（すなわち、３アミノ酸、２アミノ酸、または１アミノ酸）である。これは、第一の抗原結合ドメインのＣＨ１領域においてジスフィド結合を形成するアミノ酸残基の位置と、第二の抗原結合ドメインのＣＨ１領域においてジスフィド結合を形成するアミノ酸残基の位置とをＥＵナンバリングで比較した場合、その差（すなわち距離）が３アミノ酸以内となることを意味する。特定の態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインとの間の少なくとも1つのジスルフィド結合は、第一の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるＥＵナンバリング１３５位のアミノ酸残基と、第二の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるＥＵナンバリング１３２位から１３８位のいずれかのアミノ酸残基との間で形成される。特定の態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインとの間の少なくとも1つのジスルフィド結合は、第一の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるＥＵナンバリング１３６位のアミノ酸残基と、第二の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるＥＵナンバリング１３３位から１３９位のいずれかのアミノ酸残基と間で形成される。

　特定の態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインとの間の少なくとも1つのジスルフィド結合は、第一の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるＥＵナンバリング１９１位のアミノ酸残基と、第二の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるＥＵナンバリング１８８位から１９４位のいずれかのアミノ酸残基と間で形成される。例示的な一態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインとの間の少なくとも1つのジスルフィド結合は、２つの抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるＥＵナンバリング１３５位のアミノ酸残基との間で形成される。例示的な一態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインとの間の少なくとも1つのジスルフィド結合は、２つの抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるＥＵナンバリング１３６位のアミノ酸残基との間で形成される。例示的な一態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインとの間の少なくとも1つのジスルフィド結合は、２つの抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるＥＵナンバリング１９１位のアミノ酸残基との間で形成される。

　いくつかの態様において、本開示における抗原結合分子は第一の抗原結合ドメインと第二の抗原結合ドメインとの間に１つ、２つまたはそれより多くの追加のジスルフィド結合を含む。追加の１つ、２つまたはそれより多くのジスルフィド結合は、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインの各CH1領域の各々におけるEUナンバリングに従う以下の位置にあるアミノ酸残基を介して第一の抗原結合ドメインと第二の抗原結合ドメインとの間で形成される：
(a）2つの抗原結合ドメインの各々における131位～138位、194位および195位のいずれかの位置にあるアミノ酸残基間；
(b）2つの抗原結合ドメインの各々における131位にあるアミノ酸残基間、および2つの抗原結合ドメインの各々における194位にあるアミノ酸残基間；
(c）2つの抗原結合ドメインの各々における132位にあるアミノ酸残基間、および2つの抗原結合ドメインの各々における194位にあるアミノ酸残基間；
(d）2つの抗原結合ドメインの各々における133位にあるアミノ酸残基間、および2つの抗原結合ドメインの各々における194位にあるアミノ酸残基間；
(e）2つの抗原結合ドメインの各々における134位にあるアミノ酸残基間、および2つの抗原結合ドメインの各々における194位にあるアミノ酸残基間；
(f）2つの抗原結合ドメインの各々における135位にあるアミノ酸残基間、および2つの抗原結合ドメインの各々における194位にあるアミノ酸残基間；
(g）2つの抗原結合ドメインの各々における136位にあるアミノ酸残基間、および2つの抗原結合ドメインの各々における194位にあるアミノ酸残基間；
(h）2つの抗原結合ドメインの各々における137位にあるアミノ酸残基間、および2つの抗原結合ドメインの各々における194位にあるアミノ酸残基間；
(i）2つの抗原結合ドメインの各々における138位にあるアミノ酸残基間、および2つの抗原結合ドメインの各々における194位にあるアミノ酸残基間；
(j）2つの抗原結合ドメインの各々における131位にあるアミノ酸残基間、および2つの抗原結合ドメインの各々における195位にあるアミノ酸残基間；
(k）2つの抗原結合ドメインの各々における132位にあるアミノ酸残基間、および2つの抗原結合ドメインの各々における195位にあるアミノ酸残基間；
(l）2つの抗原結合ドメインの各々における133位にあるアミノ酸残基間、および2つの抗原結合ドメインの各々における195位にあるアミノ酸残基間；
(m）2つの抗原結合ドメインの各々における134位にあるアミノ酸残基間、および2つの抗原結合ドメインの各々における195位にあるアミノ酸残基間；
(n）2つの抗原結合ドメインの各々における135位にあるアミノ酸残基間、および2つの抗原結合ドメインの各々における195位にあるアミノ酸残基間；
(o）2つの抗原結合ドメインの各々における136位にあるアミノ酸残基間、および2つの抗原結合ドメインの各々における195位にあるアミノ酸残基間；
(p）2つの抗原結合ドメインの各々における137位にあるアミノ酸残基間、および2つの抗原結合ドメインの各々における195位にあるアミノ酸残基間；ならびに
(q）2つの抗原結合ドメインの各々における138位にあるアミノ酸残基間、および2つの抗原結合ドメインの各々における195位にあるアミノ酸残基間。

　前記局面のいくつかの態様において、第一のおよび第二の抗原結合ドメインのいずれか一方は、各CH1領域において（EUナンバリングの）136位～138位に1つ、2つまたはそれより多くの荷電アミノ酸残基を含み；かつ第一のおよび第二の抗原結合ドメインのうちもう一方の抗原結合ドメインは、各CH1領域において（EUナンバリングの）193位～195位に1つ、2つまたはそれより多くの逆に荷電したアミノ酸残基を含む。

　前記局面のいくつかの態様において第一のおよび第二の抗原結合ドメインのいずれか一方は、各CH1領域において（EUナンバリングの）136位～138位に1つ、2つまたはそれより多くの正に荷電したアミノ酸残基を含み；かつ第一のおよび第二の抗原結合ドメインのうちもう一方の抗原結合ドメインは、各CH1領域において（EUナンバリングの）193位～195位に1つ、2つまたはそれより多くの負に荷電したアミノ酸残基を含む。

　前記局面のいくつかの態様において、第一のおよび第二の抗原結合ドメインのいずれか一方は、各CH1領域において（EUナンバリングの）136位～138位に1つ、2つまたはそれより多くの負に荷電したアミノ酸残基を含み；かつ第一のおよび第二の抗原結合ドメインのうちもう一方の抗原結合ドメインは、各CH1領域において（EUナンバリングの）193位～195位に1つ、2つまたはそれより多くの正に荷電したアミノ酸残基を含む。

　前記局面のいくつかの態様において、第一のおよび第二の抗原結合ドメインのいずれか一方は、各CH1領域において（EUナンバリングに従う）以下のアミノ酸残基：
(a）グルタミン酸（E）またはアスパラギン酸（D）である136位にあるアミノ酸残基；
(b）グルタミン酸（E）またはアスパラギン酸（D）である137位にあるアミノ酸残基；
(c）グルタミン酸（E）またはアスパラギン酸（D）である138位にあるアミノ酸残基
の1つ、2つまたはそれより多くを含み；かつ
　第一のおよび第二の抗原結合ドメインのもう一方の抗原結合ドメインは、各CH1領域において（EUナンバリングに従う）以下のアミノ酸残基：
(d）リジン（K）、アルギニン（R）、またはヒスチジン（H）である193位にあるアミノ酸残基；
(e）リジン（K）、アルギニン（R）、またはヒスチジン（H）である194位にあるアミノ酸残基；および
(f）リジン（K）、アルギニン（R）、またはヒスチジン（H）である195位にあるアミノ酸残基
の1つ、2つまたはそれより多くを含む。

　前記局面のいくつかの態様において、第一のおよび第二の抗原結合ドメインのいずれか一方は、各CH1領域において（EUナンバリングに従う）以下のアミノ酸残基：
(a）リジン（K）、アルギニン（R）、またはヒスチジン（H）である136位にあるアミノ酸残基；
(b）リジン（K）、アルギニン（R）、またはヒスチジン（H）である137位にあるアミノ酸残基；
(c）リジン（K）、アルギニン（R）、またはヒスチジン（H）である138位にあるアミノ酸残基
の1つまたは複数を含み；かつ
　第一のおよび第二の抗原結合ドメインのもう一方の抗原結合ドメインは、各CH1領域において（EUナンバリングに従う）以下のアミノ酸残基：
(d）グルタミン酸（E）またはアスパラギン酸（D）である193位にあるアミノ酸残基；
(e）グルタミン酸（E）またはアスパラギン酸（D）である194位にあるアミノ酸残基；および
(f）グルタミン酸（E）またはアスパラギン酸（D）である195位にあるアミノ酸残基
の1つまたは複数を含む。

　特定の態様において、第一および第二の抗原結合ドメインの各々は、表１、表２、または表３に列記した各ＣＨ１領域における（ＥＵナンバリングに従う）特定の荷電変異の組み合わせのいずれかを含む。

　前記局面のいくつかの態様において、第一のおよび第二の抗原結合ドメインのいずれか一方は、各CH1領域において（EUナンバリングの）136位～138位に1つ、2つまたはそれより多くの疎水性アミノ酸残基を含み；かつ第一のおよび第二の抗原結合ドメインのうちもう一方の抗原結合ドメインは、各CH1領域において（EUナンバリングの）193位～195位に1つ、2つまたはそれより多くの疎水性アミノ酸残基を含む。

　前記局面のいくつかの態様において、疎水性アミノ酸残基は、アラニン（Ala）、バリン（Val）、ロイシン（Leu）、イソロイシン（Ile）、フェニルアラニン（Phe）、および/またはトリプトファン（Trp）である。

　特定の態様において、第一および第二の抗原結合ドメインの各々は、表４に列記した各ＣＨ１領域における（ＥＵナンバリングに従う）特定の疎水性アミノ酸変異の組み合わせのいずれかを含む。

　前記局面のいくつかの態様において、第一のおよび第二の抗原結合ドメインのいずれか一方は、各CH1領域において（EUナンバリングの）136位～138位に1つの「ノブ」アミノ酸残基を含み；かつ第一のおよび第二の抗原結合ドメインのうちもう一方の抗原結合ドメインは、各CH1領域において（EUナンバリングの）193位～195位に1つ、2つまたはそれより多くの「ホール」アミノ酸残基を含む。

　前記局面のいくつかの態様において、第一のおよび第二の抗原結合ドメインのいずれか一方は、各CH1領域において（EUナンバリングの）136位～138位に1つ、2つまたはそれより多くの「ホール」アミノ酸残基を含み；かつ第一のおよび第二の抗原結合ドメインのうちもう一方の抗原結合ドメインは、各CH1領域において（EUナンバリングの）193位～195位に1つの「ノブ」アミノ酸残基を含む。

　いくつかの態様において、前記「ノブ」アミノ酸残基は、トリプトファン（Trp）およびフェニルアラニン（Phe）からなる群より選択され；かつ前記「ホール」アミノ酸残基は、アラニン（Ala）、バリン（Val）、トレオニン（Thr）、およびセリン（Ser）からなる群より選択される。

　前記局面のいくつかの態様において、第一のおよび第二の抗原結合ドメインのいずれか一方は、各CH1領域において（EUナンバリングの）136位～138位に1つ、2つまたはそれより多くの芳香族アミノ酸残基を含み；かつ第一のおよび第二の抗原結合ドメインのうちもう一方の抗原結合ドメインは、各CH1領域において（EUナンバリングの）193位～195位に1つ、2つまたはそれより多くの正に荷電したアミノ酸残基を含む。

　前記局面のいくつかの態様において、第一のおよび第二の抗原結合ドメインのいずれか一方は、各CH1領域において（EUナンバリングの）136位～138位に1つ、2つまたはそれより多くの正に荷電したアミノ酸残基を含み；かつ第一のおよび第二の抗原結合ドメインのうちもう一方の抗原結合ドメインは、各CH1領域において（EUナンバリングの）193位～195位に1つ、2つまたはそれより多くの芳香族アミノ酸残基を含む。

　いくつかの態様において、前記芳香族アミノ酸残基は、トリプトファン（Trp）、チロシン（Tyr）、ヒスチジン（His）、およびフェニルアラニン（Phe）からなる群より選択され；かつ前記正に荷電したアミノ酸残基は、リジン（Lys）、アルギニン（Arg）、およびヒスチジン（His）からなる群より選択される。

　一局面において、少なくとも１つのジスルフィド結合は、第一の抗原結合ドメインのＣＬ領域おけるアミノ酸残基と第二の抗原結合ドメインのＣＬ領域におけるアミノ酸残基との間で形成される。当該アミノ酸残基は、例えば、ＣＬ領域のＫａｂａｔナンバリング１０８位から１１２位、１２１位から１２８位、１５１位から１５６位、１８４位から１９０位、１９５位から１９６位、２００位から２０３位、２０８位から２１３位のいずれかに存在する。特定の態様において、当該アミノ酸残基は、ＣＬ領域のＫａｂａｔナンバリング１０８位、１０９位、１１２位、１２１位、１２３位、１２６位、１２８位、１５１位、１５２位、１５３位、１５６位、１８４位、１８６位、１８８位、１８９位、１９０位、１９５位、１９６位、２００位、２０１位、２０２位、２０３位、２０８位、２１０位、２１１位、２１２位、および２１３位からなる群より選択されるいずれかに存在する。特定の態様において、当該アミノ酸残基は、ＣＬ領域のＫａｂａｔナンバリング１２６位に存在する。

　前記局面の一態様において、少なくとも１つのジスルフィド結合は、第一の抗原結合ドメインのＣＬ領域おけるアミノ酸残基と第二の抗原結合ドメインのＣＬ領域におけるアミノ酸残基との間で形成される。特定の態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインにおけるアミノ酸残基はそれぞれ、Kabatナンバリング108位、109位、110位、111位、および112位からなる群より独立して選択される。特定の態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインにおけるアミノ酸残基はそれぞれ、Kabatナンバリング121位、122位、123位、124位、125位、126位、127位、および 128位からなる群より独立して選択される。特定の態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインにおけるアミノ酸残基はそれぞれ、Kabatナンバリング151位、152位、153位、154位、155位、および 156位からなる群より独立して選択される。特定の態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインにおけるアミノ酸残基はそれぞれ、Kabatナンバリング184位、185位、186位、187位、188位、189位、および 190位からなる群より独立して選択される。特定の態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインにおけるアミノ酸残基はそれぞれ、Kabatナンバリング195位および196位からなる群より独立して選択される。特定の態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインにおけるアミノ酸残基はそれぞれ、Kabatナンバリング200位、201位、202位、および203位からなる群より独立して選択される。特定の態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインにおけるアミノ酸残基はそれぞれ、Kabatナンバリング208位、209位、210位、211位、212位、および213位からなる群より独立して選択される。

　前記局面の一態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインにおいてそれぞれジスルフィド結合を形成するアミノ酸残基の位置の差（すなわちそれらの間の距離）は、３アミノ酸以内（すなわち、３アミノ酸、２アミノ酸、または１アミノ酸）である。これは、第一の抗原結合ドメインのＣＬ領域においてジスフィド結合を形成するアミノ酸残基の位置と、第二の抗原結合ドメインのＣＬ領域においてジスフィド結合を形成するアミノ酸残基の位置とをＥＵナンバリングで比較した場合、その差（すなわち距離）が３アミノ酸以内となることを意味する。例示的な一態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインとの間の少なくとも1つのジスルフィド結合は、２つの抗原結合ドメインのＣＬ領域におけるＫａｂａｔナンバリング１２６位のアミノ酸残基どうしを連結させることによって形成される。

　前記局面の一態様において、少なくとも１つのジスルフィド結合は、第一の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるアミノ酸残基と、第二の抗原結合ドメインのＣＬ領域におけるアミノ酸残基との間で形成される。特定の態様において、第一の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるアミノ酸残基は、ＥＵナンバリング１８８位、１８９位、１９０位、１９１位、１９２位、１９３位、１９４位、１９５位、１９６位、および１９７位からなる群より選択され、かつ第二の抗原結合ドメインのＣＬ領域におけるアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔナンバリング１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、および１２８位からなる群より選択される。例示的な一態様において、少なくとも１つのジスルフィド結合は、第一の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるＥＵナンバリング１９１位のアミノ酸残基と、第二の抗原結合ドメインのＣＬ領域におけるＫａｂａｔナンバリング１２６位のアミノ酸残基との間で形成される。

　一局面において、定常領域はヒト由来である。特定の態様において、重鎖定常領域のサブクラスは、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgD、およびIgEのいずれかである。特定の態様において、ＣＨ１領域のサブクラスは、γ１、γ２、γ３、γ４、α１、α２、μ、δ、およびεのいずれかである。

　ある局面において、本開示における抗原結合分子は、第一のおよび第二の抗原結合部分のそれぞれの軽鎖の定常ドメインCLにおいて、123位および/または124位にあるアミノ酸が独立して、リジン（K）、アルギニン（R）、またはヒスチジン（H）によって置換されたものであってもよい（Kabatによるナンバリング）。他の局面において、本開示における抗原結合分子は、第一のおよび第二の抗原結合部分のそれぞれの重鎖の定常ドメインCH1において、147位にあるアミノ酸および/または213位にあるアミノ酸が独立して、グルタミン酸（E）またはアスパラギン酸（D）によって置換されたものであってもよい（EUナンバリングによるナンバリング）。

　ある局面において、本開示における抗原結合分子は、第一のおよび第二の抗原結合部分のそれぞれの軽鎖の定常ドメインCL、123位および124位にあるアミノ酸はそれぞれ、アルギニン（R）およびリジン（K）であることができる（Kabatによるナンバリング）。他の局面において、本開示における抗原結合分子は、第一のおよび第二の抗原結合部分のそれぞれの重鎖の定常ドメインCH1において、147位および213位にあるアミノ酸はグルタミン酸（E）であることができる（EUナンバリングによるナンバリング）。

　前記局面の一態様において、定常領域はヒト由来である。特定の態様において、ＣＬ領域のサブクラスは、κまたはλである。

　前記局面の一態様において、少なくとも１つのジスルフィド結合は、第一の抗原結合ドメインの可変領域におけるアミノ酸残基と、第二の抗原結合ドメインの可変領域におけるアミノ酸残基との間で形成される。特定の態様において、少なくとも１つのジスルフィド結合は、第一の抗原結合ドメインのＶＨ領域におけるアミノ酸残基と、第二の抗原結合ドメインのＶＨ領域におけるアミノ酸残基との間で形成される。特定の態様において、当該アミノ酸残基は、例えば、ＶＨ領域のＥＵナンバリング６位、８位、１６位、２０位、２５位、２６位、２８位、７４位、および８２ｂ位からなる群より選択されるいずれかに存在する。特定の態様において、少なくとも１つのジスルフィド結合は、第一の抗原結合ドメインのＶＬ領域におけるアミノ酸残基と、第二の抗原結合ドメインのＶＬ領域におけるアミノ酸残基との間で形成される。特定の態様において、前記アミノ酸残基は、例えば、ＶＬ領域（サブクラスκ）のＫａｂａｔナンバリング２１位、２７位、５８位、７７位、１００位、１０５位、および１０７位、ならびにＶＬ領域（サブクラスλ）のＫａｂａｔナンバリング６位、１９位、３３位、および３４位からなる群より選択されるいずれかに存在する。

　前記局面の一態様において、少なくとも１つのジスルフィド結合は、第一の抗原結合ドメインのＶＨＨ領域におけるアミノ酸残基と、第二の抗原結合ドメインのＶＨＨ領域におけるアミノ酸残基との間で形成される。特定の態様において、当該アミノ酸残基は、例えば、ＶＨＨ領域のＫａｂａｔナンバリング４位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１４位、１５位、１７位、２０位、２４位、２７位、２９位、３８位、３９位、４０位、４１位、４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、６７位、６９位、７１位、７８位、８０位、８２位、８２ｃ位、８５位、８８位、９１位、９３位、９４位、および１０７位からなる群より選択されるいずれかに存在する。

　他の態様において、本開示における抗原結合分子には、所望の組み合わせを有するH鎖間およびL鎖H鎖間の会合を促進するための他の技術を適用することができる。

　例えば、抗原結合分子の会合には、抗体H鎖の第2の定常領域または第3の定常領域（CH2またはCH3）の界面に静電気的反発を導入することにより望ましくないH鎖会合を抑制する技術を適用することができる（WO2006/106905）。

　CH2またはCH3の界面に静電気的反発を導入することにより意図しないH鎖会合を抑制する技術において、H鎖の他方の定常領域の界面で接触するアミノ酸残基の例には、CH3領域におけるEUナンバリング位置356位、439位、357位、370位、399位、および409位の残基に対応する領域が含まれる。

　より具体的には、2種のH鎖CH3領域を含む抗体であって、第1のH鎖CH3領域における、以下の（1）～（3）に示すアミノ酸残基の対から選択される1～3対のアミノ酸残基が同種の電荷を有する抗体が、例として挙げられる：（1）H鎖CH3領域に含まれる、EUナンバリング位置356位および439位のアミノ酸残基、（2）H鎖CH3領域に含まれる、EUナンバリング位置357位および370位のアミノ酸残基、ならびに（3）H鎖CH3領域に含まれる、EUナンバリング位置399位および409位のアミノ酸残基。

　さらに、該抗体は、上記第1のH鎖CH3領域とは異なる第2のH鎖CH3領域におけるアミノ酸残基の対が、前記（1）～（3）のアミノ酸残基の対から選択され、前記第1のH鎖CH3領域において同種の電荷を有する前記（1）～（3）のアミノ酸残基の対に対応する1～3対のアミノ酸残基が、前記第1のH鎖CH3領域における対応するアミノ酸残基とは反対の電荷を有する抗体であってもよい。

　上記（1）～（3）に示されるそれぞれのアミノ酸残基は、会合した際に互いに接近している。当業者であれば、所望のH鎖CH3領域またはH鎖定常領域において、市販のソフトウェアを用いたホモロジーモデリング等により、上記（1）～（3）のアミノ酸残基に対応する位置を見出すことができ、適宜、これらの位置のアミノ酸残基を改変に供することが可能である。

　上記抗原結合分子において、「電荷を有するアミノ酸残基」は、例えば、以下の群のいずれか1つに含まれるアミノ酸残基から選択されることが好ましい：
　(a) グルタミン酸（E）およびアスパラギン酸（D）、ならびに
　(b) リジン（K）、アルギニン（R）、およびヒスチジン（H）。

　上記抗原結合分子において、語句「同種の電荷を有する」とは、例えば、2つ以上のアミノ酸残基のいずれもが、上記の群(a)および(b)のうちいずれか1つに含まれるアミノ酸残基から選択されることを意味する。語句「反対の電荷を有する」とは、例えば、2つ以上のアミノ酸残基のうちの少なくとも1つのアミノ酸残基が、上記の群(a)および(b)のうちいずれか1つに含まれるアミノ酸残基から選択される場合に、残りのアミノ酸残基が他の群に含まれるアミノ酸残基から選択されることを意味する。

　好ましい態様において上記抗原結合分子は、その第1のH鎖CH3領域と第2のH鎖CH3領域がジスルフィド結合により架橋されていてもよい。

　本開示において、改変に供するアミノ酸残基は、上述した抗体可変領域または抗体定常領域のアミノ酸残基に限られない。当業者であれば、変異ポリペプチドまたは異種多量体において、市販のソフトウェアを用いたホモロジーモデリング等により、界面を形成するアミノ酸残基を同定することができ、次いでこれらの位置のアミノ酸残基を、会合を制御するように改変に供することが可能である。

　加えて、本開示における抗原結合分子の形成には他の公知技術を用いることもできる。抗原結合分子の一方のH鎖CH3の一部を対応するIgA由来の配列に変え、対応するIgA由来の配列を他方のH鎖CH3の相補的な部分に導入することにより生成された鎖交換操作ドメインCH3（strand-exchange engineered domain CH3）を用いて、異なる配列を有するポリペプチドの会合をCH3の相補的な会合によって効率的に誘導することができる (Protein Engineering Design & Selection, 23; 195-202, 2010)。この公知技術を用いて効率的に目的の抗原結合分子を形成させることもできる。

　加えて、抗原結合分子の形成には、WO2011/028952、WO2014/018572およびNat Biotechnol. 2014 Feb;32(2):191-8に記載されるような抗体のCH1とCLの会合およびVHとVLの会合を利用した抗体製造技術、WO2008/119353およびWO2011/131746に記載されるような別々に調製したモノクローナル抗体を組み合わせて使用して二重特異性抗体を製造する技術(Fab Arm Exchange)、WO2012/058768およびWO2013/063702に記載されるような抗体重鎖CH3間の会合を制御する技術、WO2012/023053に記載されるような2種類の軽鎖と1種類の重鎖とから構成され抗原結合分子を製造する技術、Christophら（Nature Biotechnology Vol. 31, p 753-758 (2013)）によって記載されるような1本のH鎖と1本のL鎖を含む抗体の片鎖をそれぞれ発現する2つの細菌細胞株を利用した抗原結合分子を製造する技術等を用いてもよい。

　あるいは、目的の抗原結合分子を効率的に形成させることができない場合であっても、産生された抗体から目的の抗原結合分子を分離し精製することによって、本開示における抗原結合分子を得ることが可能である。例えば、2種類のH鎖の可変領域にアミノ酸置換を導入することにより等電点の差を付与することで、2種類のホモ体と目的のヘテロ抗体をイオン交換クロマトグラフィーで精製することを可能にする方法が報告されている（WO2007114325）。ヘテロ抗体を精製する方法として、これまでに、プロテインAに結合するマウスIgG2aのH鎖とプロテインAに結合しないラットIgG2bのH鎖とを含むヘテロ二量化抗体を、プロテインAを用いて精製する方法が報告されている（WO98050431およびWO95033844）。さらに、IgGとプロテインAの結合部位であるEUナンバリング位置435位および436位のアミノ酸残基を、異なるプロテインA親和性をもたらすアミノ酸であるTyr、Hisなどに置換したH鎖を用いて、あるいは、異なるプロテインA親和性を有するH鎖を用いて、各H鎖とプロテインAとの相互作用を変化させ、次いでプロテインAカラムを用いることにより、ヘテロ二量化抗体のみを効率的に精製することができる。

Ｖ．それぞれが、CD3およびCD137に結合できるが、CD3およびCD137に同時には結合しない、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインと、DLL3に結合できる第三の抗原結合ドメインを含む、抗原結合分子
　一局面において、本開示における抗原結合ドメインは、それぞれが、CD3およびCD137に結合できるが、CD3およびCD137に同時には結合しない、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインと、第三の抗原、好ましくはがん細胞/組織上に発現している抗原に結合できる第三の抗原結合ドメインであることができる。すなわち、一局面において、本開示における抗原結合分子は、それぞれが、CD3およびCD137に結合できるが、CD3およびCD137に同時には結合しない、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインと、第三の抗原、好ましくはがん細胞/組織上に発現している抗原に結合できる第三の抗原結合ドメインを含む、抗原結合分子であることができる。

　ある局面において、第一の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインのそれぞれは、CD3およびCD137に結合できるが、CD3およびCD137の両方に同時には結合しない、「Dual抗原結合ドメイン」であってもよい。第三の抗原結合ドメインは、「DLL3抗原結合ドメイン」であってもよい。

　いくつかの態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのそれぞれはFab分子であり、抗原結合分子は、第一の抗原結合ドメインのCH1領域と第二の抗原結合ドメインのCH1領域との間で形成される少なくとも1つのジスルフィド結合を含む。好ましい態様において、ジスルフィド結合は、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインの各々のCH1領域中のEUナンバリングによる191位にあるアミノ酸残基（システイン残基）間で形成され得る。

　いくつかの態様において、第三の抗原結合ドメインは、FabまたはscFvであってもよく、第一の抗原結合ドメインまたは第二の抗原結合ドメインのいずれか一方に融合される。第一の、第二の、および第三の抗原結合ドメインのそれぞれが、VH領域およびCH1領域を含む重鎖と、VL領域およびCL領域を含む軽鎖とを含むFab分子である場合、第三の抗原結合ドメインは、Fab重鎖のC末端（CH1）で、第一の抗原結合ドメインまたは第二の抗原結合ドメインのいずれか一方のFab重鎖のN末端に、直接、またはペプチドリンカーを介して、融合されてもよい。代表的なペプチドリンカーには、配列番号：18、配列番号：19、または配列番号：20に記載のアミノ酸配列からなるものが含まれる。ある特定の態様において、第一の抗原結合ドメインは第二の抗原結合ドメインと同一である。

　いくつかの態様において、第三の抗原結合ドメインは、Fab軽鎖およびFab重鎖の可変領域が交換されており、かつ第一のおよび第二の抗原結合ドメインのそれぞれが従来型のFab分子である、クロスオーバーFab分子である。

　特定の態様において、Dual抗原結合ドメイン（「第一の抗原結合ドメイン」または「第二の抗原結合ドメイン」または「Dual-Fab」）は、CD3の全体もしくはその部分ペプチドの一部分に特異的に結合する。

　特定の態様において、Dual抗原結合ドメイン（「第一の抗原結合ドメイン」または「第二の抗原結合ドメイン」または「Dual-Fab」）は、CD137の全体もしくはその部分ペプチドの一部分に特異的に結合する。

　特定の態様において、本開示における抗原結合分子は、第一および第二の抗原結合ドメインのそれぞれが、同じかまたは異なり得る抗体可変領域を含み、かつ、以下の（a1）～（a4）：
（a1）配列番号：27に記載のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域（CDR）1、
　　　配列番号：28に記載のアミノ酸配列を含む重鎖CDR 2、および
　　　配列番号：29に記載のアミノ酸配列を含む重鎖CDR 3
　　　を含む重鎖可変領域、および
　　　配列番号：30に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR 1、
　　　配列番号：31に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR 2、および
　　　配列番号：32に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR 3
　　　を含む軽鎖可変領域、
　　　を含む、抗体可変領域；
（a2）配列番号：33に記載のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域（CDR）1、
　　　配列番号：34に記載のアミノ酸配列を含む重鎖CDR 2、および
　　　配列番号：35に記載のアミノ酸配列を含む重鎖CDR 3
　　　を含む重鎖可変領域、および
　　　配列番号：30に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR 1、
　　　配列番号：31に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR 2、および
　　　配列番号：32に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR 3
　　　を含む軽鎖可変領域
　　　を含む、抗体可変領域；
（a3）（a1）または（a2）に記載の抗体可変領域が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体可変領域；ならびに
（a4）（a1）または（a2）に記載の抗体可変領域と抗原に対する結合が競合する抗体可変領域
からなる群より独立して選択される抗体可変領域を含むことができる。

　特定の態様において、本開示における抗原結合分子は、第一および第二の抗原結合ドメインのそれぞれが、同じかまたは異なり得る抗体可変領域を含み、かつ、以下の（a1）～（a4）：
（a1）配列番号：36に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および、
　　　配列番号：37に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
　　　を含む、抗体可変領域；
（a2）配列番号：38に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および、
　　　配列番号：37に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
　　　を含む、抗体可変領域；
（a3）（a1）または（a2）に記載の抗体可変領域が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体可変領域；ならびに
（a4）（a1）または（a2）に記載の抗体可変領域と抗原に対する結合が競合する抗体可変領域
からなる群より独立して選択される抗体可変領域を含むことができる。

　1つの態様において、Dual抗原結合ドメイン（「第一の抗原結合ドメイン」または「第二の抗原結合ドメイン」または「Dual-Fab」）は、配列番号：36に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、または約100％同一のアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域配列、および配列番号：37に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、または約100％同一のアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域配列を含む。1つの態様において、Dual抗原結合ドメイン（「第一の抗原結合ドメイン」または「第二の抗原結合ドメイン」または「Dual-Fab」）は、配列番号：36に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号：37に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

　1つの態様において、Dual抗原結合ドメイン（「第一の抗原結合ドメイン」または「第二の抗原結合ドメイン」または「Dual-Fab」）は、配列番号：38に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、または約100％同一のアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域配列、および配列番号：37に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、または約100％同一のアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域配列を含む。1つの態様において、Dual抗原結合ドメイン（「第一の抗原結合ドメイン」または「第二の抗原結合ドメイン」または「Dual-Fab」）は、配列番号：38に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号：37に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

　本明細書において記載される抗原結合分子は、デルタ様3（DLL3）に結合できる抗原結合ドメイン（本明細書において「DLL3抗原結合ドメイン」、「第三の抗原結合ドメイン」または「DLL3に結合できる抗原結合ドメイン」とも呼ばれる）を少なくとも1つ含む。

　ある特定の態様において、抗原結合分子は、DLL3に結合できる抗原結合ドメインを1つ含む。ある特定の態様において、抗原結合分子は、DLL3に結合できる抗原結合ドメインを2つ含む。特定のそのような態様において、これらの抗原結合ドメインのそれぞれは、DLL3の同じエピトープに特異的に結合する。さらにより具体的な態様において、これらの「DLL3抗原結合ドメイン」はすべて、同一である。1つの態様において、抗原結合分子は、DLL3に特異的に結合できる免疫グロブリン分子を含む。1つの態様において、抗原結合分子は、DLL3に結合できる抗原結合ドメインを2つ以下含む。

　ある特定の態様において、DLL3抗原結合ドメインは、クロスオーバーFab分子、すなわち、Fab重鎖および軽鎖の可変領域または定常領域のいずれかが交換されているDLL3分子である。ある特定の態様において、DLL3抗原結合ドメインは、Fab軽鎖およびFab重鎖の可変領域が交換されているクロスオーバーFab分子である。

　特定の態様において、本開示における抗原結合分子は、第三の抗原結合ドメインとして、以下の（a1）～（a4）のいずれか1つ：
（a1）配列番号：46に記載のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域（CDR）1、
　　　配列番号：47に記載のアミノ酸配列を含む重鎖CDR 2、および
　　　配列番号：48に記載のアミノ酸配列を含む重鎖CDR 3
　　　を含む重鎖可変領域、および
　　　配列番号：49に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR 1、
　　　配列番号：50に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR 2、および
　　　配列番号：51に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR 3
　　　を含む軽鎖可変領域
　　　を含む、抗体可変領域；
（a2）配列番号：52に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
　　　配列番号：53に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
　　　を含む、抗体可変領域；
（a3）（a1）または（a2）に記載の抗体可変領域が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体可変領域；ならびに
（a4）（a1）または（a2）に記載の抗体可変領域と抗原に対する結合が競合する抗体可変領域
からなる群より独立して選択される抗体可変領域を含むことができる。

　1つの態様において、DLL3抗原結合ドメインは、配列番号：52に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、または約100％同一のアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域配列、および配列番号：53に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、または約100％同一のアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域配列を含む。1つの態様において、DLL3抗原結合ドメインは、配列番号：52に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号：53に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

　本開示における抗原結合分子は、Fc領域をさらに含むことができる。第一のおよび第二の抗原結合ドメインのそれぞれがFabである場合において、第一の抗原結合ドメインは、Fab重鎖のC末端でFc領域の第一のまたは第二のサブユニットのN末端に融合されてもよく、かつ第二の抗原結合ドメインは、Fab重鎖のC末端でFcドメインの残りのサブユニットのN末端に融合されてもよい。いくつかの態様において、第三の抗原結合ドメインは、C末端で第一の抗原結合ドメインまたは第二の抗原結合ドメインのいずれか一方のFab重鎖のN末端に、任意でペプチドリンカーを介して、融合される。

　上記態様のいずれかによれば、抗原結合分子の構成成分（例えば、抗原結合ドメイン、Fc領域）は、直接的に、または種々のリンカー、特に、本明細書において記載されているかまたは当技術分野において公知である1つもしくは複数のアミノ酸、典型的には約2～20個のアミノ酸を含むペプチドリンカーを通じて、融合させてもよい。適切な非免疫原性ペプチドリンカーには、例えば、(G4S)n、(SG4)n、G4(G4S)n、またはG4(SG4)nペプチドリンカーが含まれ、ここで、nは概して1～10、典型的には2～4の数である。

　特定の態様において、Fc領域は第1のFc領域サブユニットおよび第2のFc領域サブユニットを含み、
第1のFc領域サブユニットが、以下：
　234位および235位の各々にアラニンを含む、Fc領域ポリペプチド；
　234位、235位、および297位の各々にアラニンを含む、Fc領域ポリペプチド；ならびに
　234位、235位、および297位の各々にアラニン、354位にシステイン、および366位にトリプトファンを含む、Fc領域ポリペプチド
からなる群より選択され、かつ
第2のFc領域サブユニットが、以下：
　234位および235位の各々にアラニンを含む、Fc領域ポリペプチド；
　234位、235位、および297位の各々にアラニンを含む、Fc領域ポリペプチド；ならびに
　234位、235位、および297位の各々にアラニン、349位にシステイン、および366位にセリン、368位にアラニン、および407位にバリンを含む、Fc領域ポリペプチド
からなる群より選択されるものであることができる。

　ある特定の態様において、Fc領域は、以下：
（a）配列番号：23に示されるアミノ酸配列を含む第1のFcサブユニットおよび配列番号：24に示されるアミノ酸配列を含む第2のFcサブユニット；
（b）配列番号：25に示されるアミノ酸配列を含む第1のFcサブユニットおよび配列番号：26に示されるアミノ酸配列を含む第2のFcサブユニット、または
（c）配列番号：58に示されるアミノ酸配列を含む第1のFc領域サブユニットおよび配列番号：59に示されるアミノ酸配列を含む第2のFc領域サブユニット
のいずれかを含むことが好ましい。

　1つの態様において、本開示における抗原結合分子は、配列番号：39に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、または約100％同一のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：40に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、または約100％同一のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：41に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、または約100％同一のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：42に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、または約100％同一のアミノ酸配列を含む、2本のポリペプチド鎖（鎖4および鎖5）を含むものであってもよい。

　1つの態様において、本開示における抗原結合分子は、配列番号：43に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、または約100％同一のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：40に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、または約100％同一のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：44に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、または約100％同一のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：42に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、または約100％同一のアミノ酸配列を含む、2本のポリペプチド鎖（鎖4および鎖5）を含むものであってもよい。

　1つの態様において、本開示における抗原結合分子は、配列番号：45に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、または約100％同一のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：40に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、または約100％同一のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：44に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、または約100％同一のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：42に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約95％、約96％、約97％、約98％約、99％、または約100％同一のアミノ酸配列を含む、2本のポリペプチド鎖（鎖4および鎖5）を含むものであってもよい。

　ある局面において、第4のポリペプチド（鎖4）および第5のポリペプチド（鎖5）は同一である。

　特定の態様において、本開示における抗原結合分子は、
（a1）配列番号：39に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、
　　　配列番号：40に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、
　　　配列番号：41に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および
　　　配列番号：42に記載のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4および鎖5）；
（a2）配列番号：43に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、
　　　配列番号：40に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、
　　　配列番号：44に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および
　　　配列番号：42に記載のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4および鎖5）；ならびに
（a3）配列番号：45に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、
　　　配列番号：40に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、
　　　配列番号：44に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および
　　　配列番号：42に記載のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4および鎖5）；
からなる群より選択される組み合わせのいずれか1つにおける5本のポリペプチド鎖を含み、好ましくは、5本のポリペプチド鎖（鎖1～鎖5）が、図３に示される配向性に従って相互に連結および/または会合される、ものであることができる。

　特定の態様において、本開示における抗原結合分子は、
　　　配列番号：54に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、
　　　配列番号：55に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、
　　　配列番号：56に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および
　　　配列番号：57に記載のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4および鎖5）
の5本のポリペプチド鎖を含み、好ましくは、5本のポリペプチド鎖（鎖1～鎖5）が、図３に示される配向性に従って相互に連結および/または会合される、ものであることができる。

　特定の態様において、本開示における抗原結合分子は、
　　　配列番号：54に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、
　　　配列番号：55に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、
　　　配列番号：60に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および
　　　配列番号：57に記載のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4および鎖5）
の5本のポリペプチド鎖を含み、好ましくは、5本のポリペプチド鎖（鎖1～鎖5）が、図３に示される配向性に従って相互に連結および/または会合される、ものであることができる。

　本開示における抗体可変領域がCD3、CD137、およびDLL3等の抗原に結合することができるかどうかは、当技術分野において公知の方法によって判定することができる。

　これは、例えば、電気化学発光法（ECL法）によって判定することができる（BMC Research Notes 2011, 4:281）。

　具体的には、例えば、ビオチン標識された被験抗原結合分子の、抗原に結合することができる領域、例えば、Fab領域から構成される低分子抗体、またはその一価抗体（通常の抗体が有する2つのFab領域のうち1つが欠けている抗体）を、sulfo-tag（Ru錯体）で標識された抗原と混合し、混合物をストレプトアビジン固定化プレート上に添加する。この操作において、ビオチン標識された被験抗原結合分子は、プレート上のストレプトアビジンに結合する。sulfo-tagから光を発生させ、その発光シグナルを、Sector Imager 600または2400（MSD K.K.）などを用いて検出し、それによって、抗原に対する被験抗原結合分子の上述の領域の結合を確認することができる。

　あるいは、このアッセイは、ELISA、FACS（蛍光活性化細胞選別）、ALPHAScreen（増幅発光近接ホモジニアスアッセイスクリーン）、表面プラズモン共鳴（SPR）現象に基づくBIACORE法などによって実施されてもよい（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010）。

　具体的には、アッセイは、例えば、表面プラズモン共鳴（SPR）現象に基づく相互作用解析機器であるBiacore（Cytiva Japan Corp.）を用いて実施することができる。Biacore解析機器には、Biacore T100、T200、X100、A100、4000、3000、2000、1000、またはCなどの任意の機種が含まれる。CM7、CM5、CM4、CM3、C1、SA、NTA、L1、HPA、またはAuチップなどの任意のBiacore用センサーチップを、センサーチップとして用いることができる。プロテインA、プロテインG、プロテインL、抗ヒトIgG抗体、抗ヒトIgG-Fab、抗ヒトL鎖抗体、抗ヒトFc抗体、抗原タンパク質、または抗原ペプチドなどの、本開示における抗原結合分子を捕捉するためのタンパク質を、アミンカップリング、ジスルフィドカップリング、またはアルデヒドカップリングなどのカップリング法によって、センサーチップ上に固定化する。その上に抗原をアナライトとしてインジェクトし、相互作用を測定してセンサーグラムを取得する。この操作において、抗原の濃度は、アッセイサンプルの相互作用の強さ（例えば、KD）に従って数μMから数pMの範囲内で選択することができる。

　あるいは、抗原を、抗原結合分子の代わりにセンサーチップ上に固定化して、次に、評価したい抗体サンプルを相互作用させてもよい。本開示における抗原結合分子の抗体可変領域が抗原に対する結合活性を有するかどうかを、相互作用のセンサーグラムから算出された解離定数（KD）値に基づいて、または抗原結合分子サンプルの作用前のレベルを上回る、作用後のセンサーグラムの増加の程度に基づいて、確認することができる。

　いくつかの態様において、目的の抗原に対する本開示における抗体可変領域の結合活性または親和性を、例えば、Biacore T200機器（Cytiva）またはBiacore 8K機器（Cytiva）を用いて、37℃（例えばCD137について）または25℃（例えばCD3について）で評価する。抗ヒトFc（例えば、Cytiva）を、アミンカップリングキット（例えば、Cytiva）を用いてCM4センサーチップのすべてのフローセル上に固定化する。抗原結合分子または抗体可変領域を、抗Fcセンサー表面上に捕捉し、次いで、抗原をフローセル上にインジェクトする。抗原結合分子または抗体可変領域の捕捉レベルは、200レゾナンスユニット（RU）を目指してもよい。組換えヒト抗原を、2倍段階希釈によって調製した2000～125 nMでインジェクトし、その後解離させてもよい。すべての抗原結合分子または抗体可変領域およびアナライトは、20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05％ Tween 20、0.005％ NaN3を含有するACES pH 7.4において調製する。センサー表面は、サイクル毎に3M MgCl₂で再生させる。結合親和性は、例えば、Biacore Insight Evaluation software, version 2.0（Cytiva）またはBiacore 8K Evaluation software（Cytiva）を用いて、データをプロセシングし、1:1結合モデルにフィットさせることによって決定する。本開示における抗原結合ドメインの特異的結合活性または親和性を評価するために、KD値を算出する。

　ALPHAScreenは、2種類のビーズ（ドナーおよびアクセプター）を用いるALPHAテクノロジーによって、以下の原理に基づいて実施される：ドナービーズに結合した分子とアクセプタービーズに結合した分子との間の生物学的相互作用によりこれら2つのビーズが近接して位置する時にのみ、発光シグナルが検出される。レーザーによって励起されたドナービーズ中のフォトセンシタイザーは、周辺の酸素を励起状態の一重項酸素に変換する。一重項酸素は、ドナービーズ周辺に拡散し、それに近接して位置するアクセプタービーズに到達すると、それによってビーズにおける化学発光反応を引き起こし、最終的に光が放出される。ドナービーズに結合した分子とアクセプタービーズに結合した分子との間の相互作用がない場合には、ドナービーズによって産生される一重項酸素がアクセプタービーズに到達しない。したがって、化学発光反応は起きない。

　その間の相互作用を観察する物質の一方（リガンド）を、センサーチップの金薄膜上に固定する。金薄膜とガラスとの境界面で全反射するように、センサーチップの裏側から光を当てる。結果として、反射光の一部に、反射強度が低下した部位（SPRシグナル）が形成される。その間の相互作用を観察する物質の他方（アナライト）を、センサーチップの表面上にインジェクトする。アナライトがリガンドに結合すると、固定化されているリガンド分子の質量が増加して、センサーチップ表面上の溶媒の屈折率が変化する。この屈折率の変化により、SPRシグナルの位置がシフトする（逆に、結合した分子が解離すると、シグナルは元の位置に戻る）。Biacoreシステムは、シフトの量、すなわち、センサーチップ表面上の質量変化を縦座標にプロットし、質量の時間依存的変化をアッセイデータとして表示する（センサーグラム）。センサーチップ表面上に捕捉されたリガンドに結合したアナライトの量（アナライトを相互作用させた前後でのセンサーグラム上でのレスポンスの変化の量）を、センサーグラムから決定することができる。しかし、結合量はリガンドの量にも依存するため、比較は、実質的に同じ量のリガンドの量を用いる条件下で行わなければならない。キネティクス、すなわち、会合速度定数（ka）および解離速度定数（kd）は、センサーグラムの曲線から決定することができ、一方、親和性（KD）は、これらの定数の比から決定することができる。阻害アッセイもまた、BIACORE法において好適に用いられる。阻害アッセイの例は、Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010に記載されている。

　用語「CD3とCD137（4-1BB）に同時（at the same time）には結合しない」または「CD3とCD137（4-1BB）に同時（simultaneously）には結合しない」は、本開示における抗原結合ドメインまたは抗体可変領域が、CD3と結合している状態ではCD137に結合できず、逆に、抗原結合ドメインまたは抗体可変領域が、CD137と結合している状態ではCD3に結合できないことを意味する。ここで、「CD3とCD137に同時には結合しない」という句には、CD3を発現する細胞とCD137を発現する細胞とを架橋しないこと、または、各々が異なる細胞上で発現しているCD3とCD137に同時には結合しないことも含まれる。この句にはさらに、CD3およびCD137が可溶性タンパク質のように細胞膜上に発現していないか、または両方が同じ細胞上に存在する時には、可変領域が、CD3とCD137の両方に同時に結合することができるが、各々が異なる細胞上で発現しているCD3とCD137には同時には結合することができない場合も含まれる。そのような抗体可変領域は、これらの機能を有している限り、特に限定されない。その例には、所望の抗原に結合するようにそのアミノ酸の一部を改変した、IgG型の抗体可変領域に由来する可変領域が含まれ得る。改変されるアミノ酸は、例えば、CD3またはCD137に結合する抗体可変領域における、その改変が抗原に対する結合を喪失させないアミノ酸から選択される。

　ここで、「異なる細胞上で発現している」という句は、単に、抗原が別々の細胞上で発現していることを意味する。そのような細胞の組み合わせは、例えば、T細胞と別のT細胞のように同じ種類の細胞であってもよいし、またはT細胞とNK細胞のように異なる種類の細胞であってもよい。

　本開示における抗原結合分子が「CD3とCD137に同時には結合しない」かどうかは、抗原結合分子がCD3およびCD137の両方に対する結合活性を有することを確認すること；次いで、この結合活性を有する可変領域を含む抗原結合分子に、CD3またはCD137のいずれかを予め結合させること；および次いで、上述の方法によってもう1つのものに対するその結合活性の有無を判定すること、によって確認することができる。あるいは、これはまた、ELISAプレート上またはセンサーチップ上に固定化されたCD3またはCD137のいずれかに対する抗原結合分子の結合が、溶液中へのもう1つのものの添加によって阻害されるかどうかを判定することによって、確認することもできる。いくつかの態様において、本開示における抗原結合分子のCD3またはCD137のいずれかに対する結合は、もう1つに対する抗原結合分子の結合によって、少なくとも50％、好ましくは60％以上、より好ましくは70％以上、より好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上、またはいっそうより好ましくは95％以上阻害される。

　1つの局面において、1つの抗原（例えば、CD3）を固定化している間に、CD3に対する抗原結合分子の結合の阻害を、先行技術において公知の方法（すなわち、ELISA、BIACOREなど）によって、他の抗原（例えば、CD137）の存在下で決定することができる。別の局面において、CD137を固定化している間に、CD137に対する抗原結合分子の結合の阻害もまた、CD3の存在下で決定することができる。上述の2つの局面のうちのいずれか1つが実施される時に、結合が、少なくとも50％、好ましくは60％以上、好ましくは70％以上、さらに好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上、またはいっそうより好ましくは95％以上阻害されるならば、本開示における抗原結合分子は、CD3とCD137に同時には結合しないと判定される。

　いくつかの態様において、アナライトとしてインジェクトされる抗原の濃度は、固定化される他の抗原の濃度よりも少なくとも1倍、2倍、5倍、10倍、30倍、50倍、または100倍高い。

　好ましい様式において、アナライトとしてインジェクトされる抗原の濃度は、固定化される他の抗原の濃度よりも100倍高く、結合は、少なくとも80％阻害される。

　1つの態様において、抗原結合分子のCD137（固定化）結合活性についてのKD値に対する抗原結合分子のCD3（アナライト）結合活性についてのKD値の比（KD(CD3)/ KD(CD137)）を算出し、CD137（固定化）濃度よりもKD値の比（KD(CD3)/ KD(CD137)）の10倍、50倍、100倍、または200倍高い、CD3（アナライト）濃度を、上記の競合測定のために用いることができる。（例えば、KD値の比が0.1である場合は、1倍、5倍、10倍、または20倍高い濃度を選択することができる。さらに、KD値の比が10である場合は、100倍、500倍、1000倍、または2000倍高い濃度を選択することができる。）

　1つの局面において、1つの抗原（例えば、CD3）を固定化している間に、CD3に対する抗原結合分子の結合シグナルの減弱を、先行技術において公知の方法（すなわち、ELISA、ECLなど）によって、他の抗原（例えば、CD137）の存在下で決定することができる。別の局面において、CD137を固定化している間に、CD137に対する抗原結合分子の結合シグナルの減弱もまた、CD3の存在下で決定することができる。上述の2つの局面のうちのいずれか1つが実施される時に、結合シグナルが、少なくとも50％、好ましくは60％以上、好ましくは70％以上、さらに好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上、またはいっそうより好ましくは95％以上減弱されるならば、本開示における抗原結合分子は、CD3とCD137に同時には結合しないと判定される。

　1つの態様において、抗原結合分子のCD137（固定化）結合活性についてのKD値に対する抗原結合分子のCD3（アナライト）結合活性についてのKD値の比（KD(CD3)/ KD(CD137)）を算出し、CD137（固定化）濃度よりもKD値の比（KD(CD3)/ KD(CD137)）の10倍、50倍、100倍、または200倍高い、CD3（アナライト）濃度を、上記の測定のために用いることができる。（例えば、KD値の比が0.1である場合は、1倍、5倍、10倍、または20倍高い濃度を選択することができる。さらに、KD値の比が10である場合は、100倍、500倍、1000倍、または2000倍高い濃度を選択することができる。）

　具体的には、例えば、ECL法を用いる場合、ビオチン標識された被験抗原結合分子、sulfo-tag（Ru錯体）で標識されたCD3、および標識されていないCD137を準備する。被験抗原結合分子が、CD3およびCD137に結合することができるが、CD3とCD137に同時には結合しない場合、被験抗原結合分子と標識されたCD3との混合物をストレプトアビジン固定化プレート上に添加すること、およびその後の発光によって、sulfo-tagの発光シグナルが、標識されていないCD137の非存在下で検出される。対照的に、発光シグナルは、標識されていないCD137の存在下で減少する。この発光シグナルの減少を定量して、相対的な結合活性を決定することができる。この解析は、標識されたCD137および標識されていないCD3を用いて、同様に実施され得る。

　ALPHAScreenの場合、被験抗原結合分子は、競合するCD137の非存在下でCD3と相互作用して、520～620 nmのシグナルを生成する。タグ付けされていないCD137は、被験抗原結合分子との相互作用についてCD3と競合する。競合の結果として引き起こされる蛍光の減少を定量し、それによって相対的な結合活性を決定することができる。スルホ-NHS-ビオチンなどを用いたポリペプチドのビオチン化は、当技術分野において公知である。例えば、CD3をコードするポリヌクレオチドとGSTをコードするポリヌクレオチドとをインフレームで融合すること；および、結果として生じた融合遺伝子を、その発現が可能なベクターを保有する細胞などによって発現させ、その後グルタチオンカラムを用いて精製することを含む、適宜採用される方法によって、CD3をGSTでタグ付けすることができる。得られたシグナルは、好ましくは、例えば、非線形回帰解析に基づく一部位競合（one-site competition）モデルに適合したソフトウェアGRAPHPAD PRISM（GraphPad Software, Inc., San Diego）用いて解析される。この解析は、タグ付けされたCD137およびタグ付けされていないCD3を用いて、同様に解析され得る。

　あるいは、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を用いた方法が用いられてもよい。FRETとは、励起エネルギーが、近接して位置する2つの蛍光分子の間で互いに、電子共鳴によって直接移動する現象である。FRETが起こると、ドナー（励起状態を有する蛍光分子）の励起エネルギーがアクセプター（ドナーの近くに位置するもう1つの蛍光分子）に移動するため、ドナーから放射される蛍光が消失し（正確には、蛍光の寿命が短縮し）、代わりにアクセプターから蛍光が放射される。この現象の使用によって、CD3とCD137に同時に結合するか否かを解析することができる。例えば、蛍光ドナーを有するCD3および蛍光アクセプターを有するCD137が、被験抗原結合分子に同時に結合すると、ドナーの蛍光は消失し、一方、アクセプターから蛍光が放射される。そのため、蛍光波長の変化が観察される。そのような抗体は、CD3とCD137に同時に結合するものと確認される。他方で、CD3、CD137、および被験抗原結合分子の混合が、CD3と結合した蛍光ドナーの蛍光波長を変化させないならば、この被験抗原結合分子は、CD3およびCD137に結合することができるが、CD3とCD137に同時には結合しない抗原結合ドメインとみなすことができる。

　例えば、ビオチン標識された被験抗原結合分子を、ドナービーズ上のストレプトアビジンに結合させ、一方、グルタチオンSトランスフェラーゼ（GST）でタグ付けされたCD3を、アクセプタービーズに結合させる。被験抗原結合分子は、競合する第二の抗原の非存在下でCD3と相互作用して、520～620 nmのシグナルを生成する。タグ付けされていない第二の抗原は、被験抗原結合分子との相互作用についてCD3と競合する。競合の結果として引き起こされる蛍光の減少を定量し、それによって相対的な結合活性を決定することができる。スルホ-NHS-ビオチンなどを用いたポリペプチドのビオチン化は、当技術分野において公知である。例えば、CD3をコードするポリヌクレオチドとGSTをコードするポリヌクレオチドとをインフレームで融合すること；および、結果として生じた融合遺伝子を、その発現が可能なベクターを保有する細胞などによって発現させ、その後グルタチオンカラムを用いて精製することを含む、適宜採用される方法によって、CD3をGSTでタグ付けすることができる。得られたシグナルは、好ましくは、例えば、非線形回帰解析に基づく一部位競合モデルに適合したソフトウェアGRAPHPAD PRISM（GraphPad Software, Inc., San Diego）を用いて解析される。

　タグ付けは、GSTタグ付けに限定されず、ヒスチジンタグ、MBP、CBP、Flagタグ、HAタグ、V5タグ、c-mycタグなどであるがそれらに限定されない、任意のタグで実施されてもよい。被験抗原結合分子のドナービーズへの結合は、ビオチン-ストレプトアビジン反応を用いた結合に限定されない。特に、被験抗原結合分子がFcを含む場合、可能な方法には、ドナービーズ上のプロテインAまたはプロテインGなどのFc認識タンパク質を介して被験抗原結合分子を結合させることが含まれる。

　また、CD3およびCD137が、可溶性タンパク質のように細胞膜上に発現していない時、または両方が同じ細胞上に存在する時には、可変領域が、CD3とCD137に同時に結合することができるが、各々が異なる細胞上で発現しているCD3とCD137に同時には結合することができない場合もまた、当技術分野において公知の方法によってアッセイすることができる。

　具体的には、CD3およびCD137に対する同時の結合を検出するためのECL-ELISAにおいて陽性であると確認されている被験抗原結合分子をまた、CD3を発現する細胞およびCD137を発現する細胞と混合する。被験抗原結合分子は、抗原結合分子およびこれらの細胞が互いに同時に結合しない限り、異なる細胞上で発現しているCD3とCD137に同時には結合することができないことが示され得る。このアッセイは、例えば、細胞ベースのECL-ELISAによって実施することができる。CD3を発現する細胞を、予めプレート上に固定化する。被験抗原結合分子をそれに結合させた後に、CD137を発現する細胞をプレートに添加する。CD137を発現する細胞上でのみ発現している異なる抗原は、この抗原に対するsulfo-tagで標識された抗体を用いて検出される。抗原結合分子が、それぞれ2つの細胞上で発現している2つの抗原に同時に結合する場合は、シグナルが観察される。抗原結合分子がこれらの抗原に同時には結合しない場合は、いかなるシグナルも観察されない。

　あるいは、このアッセイは、ALPHAScreen法によって実施されてもよい。被験抗原結合分子を、ドナービーズに結合したCD3を発現する細胞およびアクセプタービーズに結合したCD137を発現する細胞と混合する。抗原結合分子が、それぞれ2つの細胞上で発現している2つの抗原に同時に結合する場合は、シグナルが観察される。抗原結合分子がこれらの抗原に同時には結合しない場合は、シグナルは観察されない。

　あるいは、このアッセイは、Octet相互作用解析法によって実施されてもよい。最初に、ペプチドタグを付加したCD3を発現する細胞を、ペプチドタグを認識するバイオセンサーに結合させる。CD137を発現する細胞および被験抗原結合分子を、ウェルに入れて、相互作用について解析する。抗原結合分子が、それぞれ2つの細胞上で発現している2つの抗原に同時に結合する場合は、被験抗原結合分子およびCD137を発現する細胞のバイオセンサーへの結合によって引き起こされる大きな波長シフトが観察される。抗原結合分子がこれらの抗原に同時には結合しない場合は、被験抗原結合分子のみのバイオセンサーへの結合によって引き起こされる小さな波長シフトが観察される。

　結合活性に基づくこれらの方法の代わりに、生物活性に基づくアッセイが実施されてもよい。例えば、CD3を発現する細胞およびCD137を発現する細胞を、被験抗原結合分子と混合して培養する。それぞれ2つの細胞上で発現している2つの抗原は、抗原結合分子がこれらの2つの抗原に同時に結合する場合は、被験抗原結合分子を介して相互に活性化される。そのため、抗原のそれぞれの下流のリン酸化レベルの増加などの活性化シグナルの変化を、検出することができる。あるいは、サイトカインの産生が、活性化の結果として誘導される。そのため、産生されるサイトカインの量を測定し、それによって、2つの細胞に同時に結合するか否かを確認することができる。あるいは、CD137を発現する細胞に対する細胞傷害活性が、活性化の結果として誘導される。あるいは、レポーター遺伝子の発現が、活性化の結果として、CD137またはCD3のシグナル伝達経路の下流で活性化されるプロモーターによって誘導される。そのため、細胞傷害活性または産生されるレポータータンパク質の量を測定し、それによって、2つの細胞に同時に結合するか否かを確認することができる。

　別の局面において、CD3およびCD137への結合に関してある参照抗原結合分子と競合する抗原結合分子を同定するために、競合アッセイが使用され得る。特定の態様において、そのような抗原結合分子は、参照抗原結合分子によって結合されるのと同じCD3およびCD137上の部位（エピトープ、例えば、線状または立体構造エピトープ）に結合する。ポリペプチドが結合するエピトープをマッピングする、詳細な例示的方法は、Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)に提供されている。エピトープマッピング法により参照抗原結合分子が結合する抗原上の部位（エピトープ）を解析し、同定されたエピトープを含むペプチドを用いて、これに結合する抗原結合分子を調製することにより、参照抗原結合分子が結合する抗原上の部位と同じ部位に結合する抗原結合分子を得ることができる。

　例示的な競合アッセイについて以下に記載される。固定化された抗原（例えば、CD3およびCD137）は、該抗原に結合する第1の標識された抗原結合分子（物質）および該抗原への結合に関して第1の物質と競合する能力に関して試験される第2の未標識の抗原結合分子（物質）を含む溶液中でインキュベートされる。対照として、固定化された抗原、第1の標識された物質を含むが第2の未標識の物質を含まない溶液中でインキュベートされる。第1の物質の抗原に対する結合を許容する条件下でのインキュベーションの後、余分な未結合の物質が除去され、固定化された抗原に結合した標識の量が測定される。固定化された抗原に結合した標識の量が対照サンプルと比較して試験サンプルにおいて実質的に減少している場合、それは第2の分子が該抗原への結合に関して第1の物質と競合していることを示す。Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) を参照のこと。

　別の例示的な競合測定法では、BIACORE(登録商標)解析を用いて、被験物質が第2(参照)物質による抗原への結合と競合する能力を決定する。BIACORE(登録商標)機器(例えば、BIACORE(登録商標)3000）をメーカーの推奨にしたがって操作する更なる局面において、当技術分野で公知の標準的な技術を用いて抗原をCM5 BIACORE(登録商標)チップ上に捕捉し、抗原でコーティングされた表面を作成する。典型的には、200～800共鳴単位の抗原をチップに結合させる(容易に測定可能なレベルの結合をもたらすが、使用される被験物質の濃度で容易に飽和可能な量)。互いと競合する能力について評価される2つの物質(すなわち、被験物質と参照物質)を、適切な緩衝液中に結合部位のモル比1：1で混合して、混合物を生成する。結合部位に基づいて該濃度を算出する場合、被験物質または参照物質の分子量は、対応する物質の総分子量を該物質上の抗原結合部位の数で割ったものとする。該混合物中の各該物質(すなわち、被験物質と参照物質)の濃度は、BIACORE(登録商標)チップ上に捕捉された抗原分子上の該物質の結合部位を容易に飽和するように充分に高くなければならない。混合物中の被験物質と参照物質は、(結合に基づいて)同じモル濃度であり、典型的には(結合部位に基づいて)1.00～1.5マイクロモルである。被験物質だけ、および参照物質だけを含有する別個の溶液も調製する。これらの溶液中の被験物質および参照物質は、該混合物と同じ緩衝液中にあり、同じ濃度および条件とすることができる。被験物質と参照物質を含有する該混合物に、抗原でコーティングしたBIACORE(登録商標)チップ上を通過させて、結合の総量を記録する。次いで、チップに結合した抗原に損傷を与えることなく結合した被験物質または参照物質を除去するように、チップを処理する。典型的には、これは、チップを30mM HClで60秒間処理することによって行われる。その後、被験物質だけの溶液に、抗原でコーティングした表面上を通過させて、結合の量を記録する。再度、チップに結合させた抗原に損傷を与えることなく結合した物質の全てを除去するように、チップを処理する。その後、参照物質だけの溶液に、抗原でコーティングした表面上を通過させて、結合の量を記録する。次に、被験物質と参照物質の混合物の結合の理論上の最大値を算出するが、これは、抗原表面上を単独で通過したときの各物質(すなわち、試験および参照)の結合の合計である。該混合物の実際の記録された結合がこの理論上の最大値よりも小さい場合には、被験物質と参照物質が抗原への結合に関して互いと競合している。したがって、一般的に、競合する被験物質は、上記のBIACORE(登録商標)ブロッキング測定法の間に、参照物質の存在下で、記録される結合が、組み合わせた被験物質と参照物質の理論上の結合最大値(上記で定義した通り)の80％と0.1％の間(例えば、80％＞～4％)、特に、理論上の結合最大値の75％と0.1％の間(例えば、75％～4％)、より具体的には理論上の結合最大値の70％と0.1％の間(例えば、70％～4％)となるように該測定法において抗原に結合する、物質である。

　別の例示的な競合測定法では、BIACORE(登録商標)解析を用いて、被験物質が第2(参照)物質による抗原への結合と競合する能力を決定する。BIACORE(登録商標)機器(例えば、BIACORE(登録商標)3000）をメーカーの推奨にしたがって操作する更なる局面において、当技術分野で公知の標準的な技術を用いて参照物質をBIACORE(登録商標)チップ上に捕捉し、参照物質でコーティングされた表面を作成する。典型的には、200～800共鳴単位の参照物質をチップに結合させる(容易に測定可能なレベルの抗原結合をもたらす量)。参照物質と競合する能力について評価される被験物質と抗原を、適切な緩衝液中に混合して、混合物を生成する。抗原だけを含有する別個の溶液も調製する。これらの溶液中抗原は、該混合物と同じ緩衝液中にあり、同じ濃度および条件とすることができる。抗原だけを含有する溶液に、参照物質でコーティングしたBIACORE(登録商標)チップ上を通過させて、結合の総量を記録する。チップの再生のためには、チップ表面にコーティングされた参照物質を除去するように、チップを処理する。例えば、Protein Aが共有結合にて固相化されたBIACORE(登録商標)チップに抗体を介して参照物質がコーティングされていた場合、10mM Glycine-HClで処理し、Protein Aに結合した抗体を除去することで行われる。その後、被験物質と抗原を含有する該混合物に、参照物質でコーティングしたBIACORE(登録商標)チップ上を通過させて、結合の総量を記録する。抗原だけを含有する溶液を通過させた際に記録した結合の総量と比較して、被験物質と抗原を含有する該混合物を通過させた際に記録した結合の総量の方が小さい場合には、その被験物質と参照物質は競合する物質である。限定はされないが、被験物質と参照物質が競合するとは、（抗原だけを含有する溶液を通過させた際の結合の総量）にて（被験物質と抗原を含有する試験混合物を通過させた際の結合の総量）を割った値が、０．８以下、０．７以下、０．６以下、又は０．５以下であることを意味してよい。

　一局面において、基質に担持される抗原結合分子には、以下に記載するような、当業者に周知の方法により作製される態様も含まれる。これらに限定されるものではないが、抗原結合分子は、異なる特異性を有する2つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖ペアの組み換え共発現（Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)、WO93/08829、およびTraunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991) 参照）、および「knob-in-hole」（「knobs-in-holes」または「KiH」とも呼ばれる）技術（例えば、米国特許第5,731,168号参照）を使用して作製することができる。抗原結合分子は、Fcヘテロ二量体分子を作製するために静電ステアリング効果 (electrostatic steering effects) を操作すること (WO2009/089004A1)；2つ以上の抗体または断片を架橋すること（米国特許第4,676,980号およびBrennan et al., Science, 229: 81 (1985)参照）；ロイシンジッパーを用いて2つの特異性を有する抗体を作成すること（Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992) 参照）；「ダイアボディ」技術を用いて二重特異性抗体断片を作製すること（Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) 参照）；および、単鎖Fv (scFv) 二量体を用いること（Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994) 参照）；および、例えばTutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991) に記載されるように三重特異性抗体を調製すること、によって作製してもよい。

　「オクトパス抗体」を含む、3つ以上の機能的抗原結合部位を伴う改変抗体も、本明細書における抗原結合分子に含まれる（例えば、米国特許出願公開第2006/0025576号A1参照）。

抗原結合分子バリアント
　特定の態様において、本開示における抗原結合分子のアミノ酸配列バリアントも、考慮の内である。例えば、抗原結合分子の結合アフィニティおよび／または他の生物学的特性を改善することが、望ましいこともある。抗原結合分子のアミノ酸配列バリアントは、抗原結合分子をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入すること、または、ペプチド合成によって、調製されてもよい。そのような修飾は、例えば、抗原結合分子のアミノ酸配列からの欠失、および／または抗体のアミノ酸配列中への挿入、および／または抗体のアミノ酸配列中の残基の置換を含む。最終構築物が所望の特徴（例えば、抗原結合性）を備えることを前提に、欠失、挿入、および置換の任意の組合せが、最終構築物に至るために行われ得る。

ａ）置換、挿入、および欠失バリアント
　特定の態様において、本開示における抗原結合分子は、1つまたは複数のアミノ酸置換を有する抗原結合分子バリアントを含む。置換的変異導入の目的部位は、HVRおよびFRを含む。保存的置換を、以下の表の「好ましい置換」の見出しの下に示す。より実質的な変更を、この表の「例示的な置換」の見出しの下に提供するとともに、アミノ酸側鎖のクラスに言及しつつ下で詳述する。アミノ酸置換は目的の抗原結合分子に導入されてもよく、産物は、例えば、保持／改善された抗原結合性、減少した免疫原性、または改善したADCCまたはCDCなどの、所望の活性についてスクリーニングされてもよい。

　アミノ酸は、共通の側鎖特性によって群に分けることができる：
(1) 疎水性：ノルロイシン、メチオニン (Met)、アラニン (Ala)、バリン (Val)、ロイシン (Leu)、イソロイシン (Ile)；
(2) 中性の親水性：システイン (Cys)、セリン (Ser)、トレオニン (Thr)、アスパラギン (Asn)、グルタミン (Gln)；
(3) 酸性：アスパラギン酸 (Asp)、グルタミン酸 (Glu)；
(4) 塩基性：ヒスチジン (His)、リジン (Lys)、アルギニン (Arg)；
(5) 鎖配向に影響する残基：グリシン (Gly)、プロリン (Pro)；
(6) 芳香族性：トリプトファン (Trp)、チロシン (Tyr)、フェニルアラニン (Phe)。
非保存的置換は、これらのクラスの1つのメンバーを、別のクラスのものに交換することをいう。

　置換バリアントの1つのタイプは、親抗原結合分子（例えば、ヒト化またはヒト抗体）の1つまたは複数の超可変領域残基の置換を含む。通常、その結果として生じ、さらなる研究のために選ばれたバリアントは、親抗原結合分子と比較して特定の生物学的特性における修飾（例えば、改善）（例えば、増加したアフィニティ、減少した免疫原性）を有する、および／または親抗原結合分子の特定の生物学的特性を実質的に保持しているであろう。例示的な置換バリアントは、アフィニティ成熟抗体であり、これは、例えばファージディスプレイベースのアフィニティ成熟技術（例えば本明細書に記載されるもの）を用いて適宜作製され得る。簡潔に説明すると、1つまたは複数のHVR残基を変異させ、そしてバリアント抗体をファージ上に提示させ、特定の生物学的活性（例えば、結合アフィニティ）に関してスクリーニングを行う。

　改変（例えば、置換）は、例えば抗原結合分子のアフィニティを改善するために、HVRにおいて行われ得る。そのような改変は、HVRの「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセスの間に高頻度で変異が起こるコドンによってコードされる残基（例えば、Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008) を参照のこと）および／または抗原に接触する残基において行われ得、得られたバリアントVHまたはVLが結合アフィニティに関して試験され得る。二次ライブラリからの構築および再選択によるアフィニティ成熟が、例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)) に記載されている。アフィニティ成熟のいくつかの態様において、多様性は、任意の様々な方法（例えば、エラープローンPCR、チェーンシャッフリングまたはオリゴヌクレオチド指向変異導入）によって成熟のために選択された可変遺伝子に導入される。次いで、二次ライブラリが作製される。次いで、このライブラリは、所望のアフィニティを有する任意の抗原結合分子バリアントを同定するためにスクリーニングされる。多様性を導入する別の方法は、いくつかのHVR残基（例えば、一度に4～6残基）を無作為化するHVR指向アプローチを含む。抗原結合に関与するHVR残基は、例えばアラニンスキャニング変異導入またはモデリングを用いて、具体的に特定され得る。特に、CDR-H3およびCDR-L3がしばしば標的化される。

　特定の態様において、置換、挿入、または欠失は、そのような改変が抗原に結合する抗原結合分子の能力を実質的に減少させない限り、1つまたは複数のHVR内で行われ得る。例えば、結合アフィニティを実質的に減少させない保存的改変（例えば、本明細書に記載の保存的置換）が、HVRにおいて行われ得る。そのような改変は、例えば、HVRの抗原接触残基の外側であり得る。上記のバリアントVHおよびVL配列の特定の態様において、各HVRは改変されていないか、わずか1つ、2つ、もしくは3つのアミノ酸置換を含む。

　変異導入のために標的化され得る抗原結合分子の残基または領域を同定するのに有用な方法は、Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085によって記載される、「アラニンスキャニング変異導入」と呼ばれるものである。この方法において、一残基または一群の標的残基（例えば、荷電残基、例えばアルギニン、アスパラギン酸、ヒスチジン、リジン、およびグルタミン酸）が同定され、中性または負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニンもしくはポリアラニン）で置き換えられ、抗原結合分子と抗原の相互作用が影響を受けるかどうかが決定される。この初期置換に対して機能的感受性を示したアミノ酸位置に、さらなる置換が導入され得る。あるいはまたは加えて、抗原結合分子と抗原の間の接触点を同定するために、抗原と抗原結合分子の複合体の結晶構造を解析してもよい。そのような接触残基および近隣の残基を、置換候補として標的化してもよく、または置換候補から除外してもよい。バリアントは、それらが所望の特性を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされ得る。

　本開示における抗原結合分子との関連において、所望の特性（活性）の例には、特に限定されるものではないが、結合活性、中和活性、細胞傷害活性、アゴニスト活性、アンタゴニスト活性、および酵素活性を挙げることができる。アゴニスト活性とは、例えば受容体などの抗原に抗体が結合することにより、細胞内にシグナルが伝達されて、何らかの生理的活性の変化を誘導する活性である。生理的活性の例としては、増殖活性、生存活性、分化活性、転写活性、膜輸送活性、結合活性、タンパク質分解活性、リン酸化／脱リン酸化活性、酸化還元活性、転移活性、核酸分解活性、脱水活性、細胞死誘導活性、およびアポトーシス誘導活性等を挙げることができるが、これらに限定されない。

　アミノ酸配列の挿入は、配列内部への単一または複数のアミノ酸残基の挿入と同様、アミノ末端および／またはカルボキシル末端における1残基から100残基以上を含むポリペプチドの長さの範囲での融合も含む。末端の挿入の例は、N末端にメチオニル残基を伴う抗原結合分子を含む。抗原結合分子の他の挿入バリアントは、抗原結合分子のN-またはC-末端に、酵素（例えば、ADEPTのための）または抗原結合分子の血漿半減期を増加させるポリペプチドを融合させたものを含む。

ｂ）グリコシル化バリアント
　特定の態様において、本明細書における抗原結合分子は、抗原結合分子がグリコシル化される程度を増加させるまたは減少させるように改変されている。抗原結合分子へのグリコシル化部位の追加または削除は、1つまたは複数のグリコシル化部位を作り出すまたは取り除くようにアミノ酸配列を改変することにより、簡便に達成可能である。

　抗原結合分子がFc領域を含む場合、そこに付加される炭水化物が改変されてもよい。哺乳動物細胞によって産生される天然型抗体は、典型的には、枝分かれした二分岐のオリゴ糖を含み、当該オリゴ糖は通常Fc領域のCH2ドメインのAsn297にN-リンケージによって付加されている。例えば、Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997) 参照。オリゴ糖は、例えば、マンノース、N‐アセチルグルコサミン (GlcNAc)、ガラクトース、およびシアル酸などの種々の炭水化物、また、二分岐のオリゴ糖構造の「幹」中のGlcNAcに付加されたフコースを含む。いくつかの態様において、本開示における抗原結合分子中のオリゴ糖の修飾は、特定の改善された特性を伴う抗原結合分子バリアントを作り出すために行われてもよい。

　一態様において、Fc領域に（直接的または間接的に）付加されたフコースを欠く炭水化物構造体を有する抗原結合分子バリアントも、本開示における抗原結合分子に好適に用いられる。例えば、そのような抗原結合分子におけるフコースの量は、1％～80％、1％～65％、5％～65％または20％～40％であり得る。フコースの量は、例えばWO2008/077546に記載されるようにMALDI-TOF質量分析によって測定される、Asn297に付加されたすべての糖構造体（例えば、複合、ハイブリッド、および高マンノース構造体）の和に対する、Asn297における糖鎖内のフコースの平均量を計算することによって決定される。Asn297は、Fc領域の297位のあたりに位置するアスパラギン残基を表す（Fc領域残基のEUナンバリング）。しかし、複数の抗原結合分子間のわずかな配列の多様性に起因して、Asn297は、297位の±3アミノ酸上流または下流、すなわち294位～300位の間に位置することもあり得る。そのようなフコシル化バリアントは、改善されたADCC機能を有し得る。例えば、米国特許出願公開第2003/0157108号 (Presta, L.) ；第2004/0093621号 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd) を参照のこと。「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗原結合分子バリアントに関する刊行物の例は、US2003/0157108; WO2000/61739; WO2001/29246; US2003/0115614; US2002/0164328; US2004/0093621; US2004/0132140; US2004/0110704; US2004/0110282; US2004/0109865; WO2003/085119; WO2003/084570; WO2005/035586; WO2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004) を含む。脱フコシル化抗原結合分子を産生することができる細胞株の例は、タンパク質のフコシル化を欠くLec13 CHO細胞（Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；米国特許出願公開第US2003/0157108号A1、Presta, L；およびWO2004/056312A1、Adams et al.、特に実施例11）およびノックアウト細胞株、例えばアルファ-1,6-フコシルトランスフェラーゼ遺伝子FUT8ノックアウトCHO細胞（例えば、Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)；Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)；およびWO2003/085107を参照のこと）を含む。

　例えば抗原結合分子のFc領域に付加された二分枝型オリゴ糖がGlcNAcによって二分されている、二分されたオリゴ糖を有する抗原結合分子バリアントもさらに本開示における抗原結合分子に包含される。そのような抗原結合分子バリアントは、減少したフコシル化および／または改善されたADCC機能を有し得る。そのような抗体バリアントの例は、例えば、WO2003/011878 (Jean-Mairet et al.) ；米国特許第6,602,684号 (Umana et al.)；およびUS2005/0123546 (Umana et al.) に記載されている。Fc領域に付加されたオリゴ糖中に少なくとも1つのガラクトース残基を有する抗原結合分子バリアントも本開示における抗原結合分子に包含される。そのような抗原結合分子バリアントは、改善されたCDC機能を有し得る。そのような抗原結合分子バリアントは、例えば、WO1997/30087 (Patel et al.)；WO1998/58964 (Raju, S.)；およびWO1999/22764 (Raju, S.) に記載されている。

ｃ）Fc領域バリアント
　特定の態様において、本明細書における抗原結合分子のFc領域に1つまたは複数のアミノ酸修飾を導入して、それによりFc領域バリアントを生成してもよい。Fc領域バリアントは、1つまたは複数のアミノ酸ポジションのところでアミノ酸修飾（例えば、置換）を含む、ヒトFc領域配列（例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4のFc領域）を含んでもよい。

　特定の態様において、すべてではないがいくつかのエフェクター機能を備える抗原結合分子バリアントも、本発明の考慮の内であり、当該エフェクター機能は、抗原結合分子を、そのインビボでの半減期が重要であるが、特定のエフェクター機能（補体およびADCCなど）は不要または有害である場合の適用に望ましい候補とするものである。CDCおよび／またはADCC活性の減少／欠乏を確認するために、インビトロおよび／またはインビボの細胞傷害測定を行うことができる。例えば、Fc受容体（FcR）結合測定は、抗原結合分子がFcγR結合性を欠く（よってADCC活性を欠く蓋然性が高い）一方でFcRn結合能を維持することを確かめるために行われ得る。ADCCを媒介するプライマリ細胞であるNK細胞はFcγRIIIのみを発現するが、一方単球はFcγRI、FcγRII、FcγRIIIを発現する。造血細胞上のFcRの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991) の第464頁のTable 3にまとめられている。目的の分子のADCC活性を評価するためのインビトロ測定法（アッセイ）の非限定的な例は、米国特許第5,500,362号（例えば、 Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986) 参照）および Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)；米国特許第5,821,337号（Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987) 参照）に記載されている。あるいは、非放射性の測定法を用いてもよい（例えば、ACT1（商標）non-radioactive cytotoxicity assay for flow cytometry (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA)；および、CytoTox 96（登録商標）non-radioactive cytotoxicity assays 法 (Promega, Madison, WI) 参照）。このような測定法に有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞 (peripheral blood mononuclear cell: PBMC) およびナチュラルキラー (natural killer: NK) 細胞を含む。あるいはまたは加えて、目的の分子のADCC活性は、例えば、Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998) に記載されるような動物モデルにおいて、インビボで評価されてもよい。また、抗原結合分子がC1qに結合できないこと、よってCDC活性を欠くことを確認するために、C1q結合測定を行ってもよい。例えば、WO2006/029879 および WO2005/100402のC1qおよびC3c結合ELISAを参照のこと。また、補体活性化を評価するために、CDC測定を行ってもよい（例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)；Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003)；およびCragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004) 参照）。さらに、FcRn結合性およびインビボでのクリアランス／半減期の決定も、当該技術分野において知られた方法を用いて行い得る（例えばPetkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006) 参照）。

　減少したエフェクター機能を伴う抗原結合分子は、Fc領域残基238、265、269、270、297、327、および329の1つまたは複数の置換を伴うものを含む（米国特許第6,737,056号）。このようなFc変異体は、残基265および297のアラニンへの置換を伴ういわゆる「DANA」Fc変異体（米国特許第7,332,581号）を含む、アミノ酸ポジション265、269、270、297、および327の2つ以上の置換を伴うFc変異体を含む。

　FcRsへの増加または減少した結合性を伴う特定の抗原結合分子バリアントが、記述されている。（米国特許第6,737,056号；WO2004/056312、およびShields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001) を参照のこと。）

　特定の態様において、抗原結合分子バリアントは、ADCCを改善する1つまたは複数のアミノ酸置換（例えば、Fc領域のポジション298、333、および／または334（EUナンバリングでの残基）のところでの置換）を伴うFc領域を含む。

　いくつかの態様において、例えば米国特許第6,194,551号、WO99/51642、およびIdusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000) に記載されるように、改変された（つまり、増加したか減少したかのいずれかである）C1q結合性および／または補体依存性細胞傷害 (CDC) をもたらす改変が、Fc領域においてなされる。

　増加した半減期、および新生児型Fc受容体（FcRn：母体のIgG類を胎児に移行させる役割を負う（Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) and Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)））に対する増加した結合性を伴う抗体が、米国特許出願公開第2005/0014934号A1(Hinton et al.) に記載されている。これらの抗体は、Fc領域のFcRnへの結合性を増加する1つまたは複数の置換をその中に伴うFc領域を含む。このようなFcバリアントは、Fc領域残基：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424、または434の1つまたは複数のところでの置換（例えば、Fc領域残基434の置換（米国特許第7,371,826号））を伴うものを含む。

　Fc領域バリアントの他の例については、Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)；米国特許第5,648,260号；米国特許第5,624,821号；およびWO94/29351も参照のこと。

ｄ）システイン改変抗原結合分子バリアント
　特定の態様において、抗原結合分子の1つまたは複数の残基がシステイン残基で置換された、システイン改変抗原結合分子（例えば、「thioMAbs」）を作り出すことが望ましいだろう。特定の態様において、置換を受ける残基は、抗原結合分子の、アクセス可能な部位に生じる。それらの残基をシステインで置換することによって、反応性のチオール基が抗原結合分子のアクセス可能な部位に配置され、当該反応性のチオール基は、当該抗原結合分子を他の部分（薬剤部分またはリンカー‐薬剤部分など）にコンジュゲートして本明細書でさらに詳述するようにイムノコンジュゲートを作り出すのに使用されてもよい。特定の態様において、以下の残基の任意の1つまたは複数が、システインに置換されてよい：軽鎖のV205（Kabatナンバリング）；重鎖のA118（EUナンバリング）；および重鎖Fc領域のS400（EUナンバリング）。システイン改変抗原結合分子は、例えば、米国特許第7,521,541号に記載されるようにして生成されてもよい。

ｅ）抗原結合分子誘導体
　特定の態様において、抗原結合分子は、当該技術分野において知られておりかつ容易に入手可能な追加の非タンパク質部分を含むように、さらに修飾されてもよい。抗原結合分子の誘導体化に好適な部分は、これに限定されるものではないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例は、これらに限定されるものではないが、ポリエチレングリコール (PEG)、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ１,3ジオキソラン、ポリ1,3,6,トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれでも）、および、デキストランまたはポリ（n-ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール類（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール、および、これらの混合物を含む。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、その水に対する安定性のために、製造において有利であるだろう。ポリマーは、いかなる分子量でもよく、枝分かれしていてもしていなくてもよい。抗原結合分子に付加されるポリマーの数には幅があってよく、1つ以上のポリマーが付加されるならそれらは同じ分子であってもよいし、異なる分子であってもよい。一般的に、誘導体化に使用されるポリマーの数および／またはタイプは、これらに限定されるものではないが、改善されるべき抗原結合分子の特定の特性または機能、抗原結合分子誘導体が規定の条件下での療法に使用されるか否か、などへの考慮に基づいて、決定することができる。

　別の態様において、抗原結合分子は、放射線に曝露することにより選択的に熱せられ得る非タンパク質部分との、コンジュゲートであってもよい。一態様において、非タンパク質部分は、カーボンナノチューブである（Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)）。放射線はいかなる波長でもよく、またこれらに限定されるものではないが、通常の細胞には害を与えないが抗原結合分子‐非タンパク質部分に近接した細胞を死滅させる温度まで非タンパク質部分を熱するような波長を含む。

組み換えの方法および構成
　例えば、米国特許第4,816,567号に記載されるとおり、抗原結合分子は組み換えの方法や構成を用いて製造することができる。一態様において、本開示における抗原結合分子（本明細書に記載の抗原結合ドメインを含むポリペプチド）をコードする、単離された核酸が提供される。そのような核酸は、抗原結合分子のVLを含むアミノ酸配列および／またはVHを含むアミノ酸配列（例えば、抗原結合分子の軽鎖および／または重鎖）をコードしてもよい。さらなる態様において、このような核酸を含む1つまたは複数のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。さらなる態様において、このような核酸を含む宿主細胞が提供される。このような態様の1つでは、宿主細胞は、(1)抗原結合分子のVLを含むアミノ酸配列および抗原結合分子のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または、(2)抗原結合分子のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一のベクターと抗原結合分子のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第二のベクターを含む（例えば、形質転換されている）。一態様において、宿主細胞は、真核性である（例えば、チャイニーズハムスター卵巣 (CHO) 細胞）またはリンパ系の細胞（例えば、Y0、NS0、Sp2/0細胞））。一態様において、抗原結合分子は、抗原結合分子の発現に好適な条件下で、上述のとおり当該抗原結合分子をコードする核酸を含む宿主細胞を培養すること、および任意で、当該抗原結合分子を宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から回収することを通して取得することができる。

　本開示における抗原結合分子の組み換え製造のために、（例えば、上述したものなどの）抗原結合分子をコードする核酸を単離し、さらなるクローニングおよび／または宿主細胞中での発現のために、1つまたは複数のベクターに挿入する。そのような核酸は、従来の手順を用いて容易に単離および配列決定されるだろう（例えば、抗原結合分子の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることで）。

　抗原結合分子をコードするベクターのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞は、本明細書に記載の原核細胞または真核細胞を含む。例えば、抗原結合分子は、特にグリコシル化およびFcエフェクター機能が必要とされない場合は、細菌で作製してもよい。細菌での抗体断片およびポリペプチドの発現に関して、例えば、米国特許第5,648,237号、第5,789,199号、および第5,840,523号を参照のこと。（加えて、大腸菌における抗体断片の発現について記載したCharlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp.245-254も参照のこと。）発現後、抗原結合分子は細菌細胞ペーストから可溶性フラクション中に単離されてもよく、またさらに精製することができる。

　原核生物に加え、部分的なまたは完全なヒトのグリコシル化パターンを伴う抗原結合分子の産生をもたらす、グリコシル化経路が「ヒト化」されている菌類および酵母の株を含む、糸状菌または酵母などの真核性の微生物は、抗原結合分子コードベクターの好適なクローニングまたは発現宿主である。Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)および Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006) を参照のこと。

　多細胞生物（無脊椎生物および脊椎生物）に由来するものもまた、グリコシル化された抗原結合分子の発現のために好適な宿主細胞である。無脊椎生物細胞の例は、植物および昆虫細胞を含む。昆虫細胞との接合、特にSpodoptera frugiperda細胞の形質転換に用いられる、数多くのバキュロウイルス株が同定されている。

　植物細胞培養物も、宿主として利用することができる。例えば、米国特許第5,959,177号、第6,040,498号、第6,420,548号、第7,125,978号、および第6,417,429号（トランスジェニック植物で抗原結合分子を産生するための、PLANTIBODIES（商標）技術を記載）を参照のこと。

　脊椎動物細胞もまた宿主として使用できる。例えば、浮遊状態で増殖するように適応された哺乳動物細胞株は、有用であろう。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、SV40で形質転換されたサル腎CV1株 (COS-7)；ヒト胎児性腎株（Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977) などに記載の293または293細胞）；仔ハムスター腎細胞 (BHK)；マウスセルトリ細胞（Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980) などに記載のTM4細胞）；サル腎細胞 (CV1)；アフリカミドリザル腎細胞 (VERO-76)；ヒト子宮頸部癌細胞 (HELA)；イヌ腎細胞 (MDCK)；Buffalo系ラット肝細胞 (BRL 3A)；ヒト肺細胞 (W138)；ヒト肝細胞 (Hep G2)；マウス乳癌 (MMT 060562)；TRI細胞（例えば、Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982) に記載）；MRC5細胞；および、FS4細胞などである。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、DHFR－ CHO細胞 (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)) を含むチャイニーズハムスター卵巣 (CHO) 細胞；およびY0、NS0、およびSp2/0などの骨髄腫細胞株を含む。抗原結合分子産生に好適な特定の哺乳動物宿主細胞株の総説として、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003) を参照のこと。

　本明細書において記載される抗原結合分子の組換え産生は、抗原結合分子全体または抗原結合分子の一部を含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む1つまたは複数のベクターを含む（例えば、それによって形質転換されている）宿主細胞を用いることによって、上記に記載されたものと同様の方法で行うことができる。

測定法（アッセイ）
　本開示における抗原結合分子は、当該技術分野において知られている種々の測定法によって、同定され、スクリーニングされ、または物理的／化学的特性および／または生物学的活性について明らかにされてもよい。

ａ）結合測定法およびその他の測定法
　一局面において、本開示における抗原結合分子は、例えばELISA、ウエスタンブロット等の公知の方法によって、その抗原結合活性に関して試験される。

ｂ）活性測定法
　一局面において、抗原結合分子はいかなる生物学的活性を発揮するものであってもよい。生物学的活性は、例えば、２つの抗原分子を空間的に近接した位置に保持する活性、２つの抗原分子間での相互作用を制御する活性、リガンドによる受容体の活性化を促進する活性、酵素の基質に対する触媒反応を促進する活性、第一の抗原を発現する細胞と第二の抗原を発現する細胞との間での相互作用を促進する活性、細胞傷害活性を有する細胞（例えばＴ細胞、ＮＫ細胞、単球、マクロファージなど）による標的細胞の損傷を促進する活性、互いに会合することによって活性化される２つの抗原分子の活性化を制御する活性、およびプロテアーゼ切断に対する抵抗性を含んでよい。また、このような生物学的活性をインビボおよび／またはインビトロで有する抗原結合分子も、好適に用いられる。

　また、本開示における抗原結合分子は、それが結合する抗原分子の種類に依存して、種々の生物学的活性を発揮することができる。そのような抗原結合分子の例としては、T細胞受容体（TCR）複合体（例えばCD3）に結合する抗原結合分子であって、T細胞の活性化を誘導する活性（アゴニスト活性）を有する抗原結合分子；TNF受容体スーパーファミリー（例えば、OX40または4-1BB）の分子または他の共刺激分子（例えばCD28またはICOS）に結合する抗原結合分子であって、上記活性化を促進する活性（アゴニスト活性）を有する抗原結合分子；等が挙げられる。特定の態様において、そのような抗原分子との結合を介して発揮される生物学的活性は、本開示における抗原結合分子に含まれる２つ以上の抗原結合ドメインの連結によって増強または減弱される。理論によって限定されるものではないが、特定の態様において、そのような増強または減弱は、本開示における抗原結合分子との結合によって２つ以上の抗原分子間の相互作用が制御される（例えば、２つ以上の抗原分子の会合が促進される）ため達成されうる。

　特定の態様において、本開示における抗原結合分子は、このような生物学的活性について試験される。２つの抗原分子が空間的に近接して保持されているかどうかは、抗原および抗原結合分子からなる複合体の結晶構造解析や電子顕微鏡観察、電子線トモグラフィー（electron tomography）による構造解析などの手法を用いて評価を行うことができる。２つの抗原結合ドメインが互いに空間的に近接しているかどうか、あるいは２つの抗原結合ドメインの可動性が減少しているかどうかも上記の手法を用いて評価を行うことができる。特に、電子線トモグラフィーを用いたIgG分子の三次元構造の解析手法については、例えばZhang et al., Sci. Rep. 5:9803 (2015) などを参照されたい。電子線トモグラフィーでは、測定対象の分子が取り得る構造の出現頻度をヒストグラムで表すことが可能なため、ドメインの可動性の減少といった構造的変化を分布で評価することができる。例えば、２つのドメイン間の距離および角度といった構造に関するパラメーターが取り得る数値とその出現頻度との関係をヒストグラムで表した場合、その分布範囲が減少すれば、２つのドメインの可動性も減少したと判断することができる。２つの抗原分子が相互作用等することによって発揮される活性については、標的となる抗原分子の種類に応じて、公知の活性測定系の中から適切なものを選択し、それらを用いて評価を行うことができる。プロテアーゼ切断に対する影響については、当業者公知の方法、あるいは後述の実施例に記載の方法などを用いて評価を行うことができる。

ＶＩ．調製物、医薬組成物、薬学的製剤
　本開示は、本明細書に記載の方法によって製造される、ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間で形成される少なくとも１つのジスルフィド結合を有する抗原結合分子を含む調製物に関する。本明細書に記載の抗原結合分子の調製物は、所望の純度を有する抗原結合分子を、1つまたは複数の任意の薬学的に許容される担体 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)) と混合することによって、医薬組成物または薬学的製剤の形態とすることができる。すなわち本開示は、本明細書に記載の方法によって製造される、ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間で形成される少なくとも１つのジスルフィド結合を有する抗原結合分子を含む調製物を含む、医薬組成物または薬学的製剤に関する。本開示における医薬組成物または薬学的製剤は、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、調製される。薬学的に許容される担体は、概して、用いられる際の用量および濃度ではレシピエントに対して非毒性であり、これらに限定されるものではないが、以下のものを含む：リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む、抗酸化剤；保存料（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、またはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；3-ペンタノール；およびm-クレゾールなど）；低分子（約10残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む、単糖、二糖、および他の炭水化物；EDTAなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、ソルビトールなどの、砂糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン類；金属錯体（例えば、Zn-タンパク質錯体）；および／またはポリエチレングリコール (PEG) などの非イオン系表面活性剤。本明細書の例示的な薬学的に許容される担体は、さらに、可溶性中性活性型ヒアルロニダーゼ糖タンパク質 (sHASEGP)（例えば、rHuPH20 (HYLENEX（登録商標）、Baxter International, Inc.) などのヒト可溶性PH-20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質）などの間質性薬剤分散剤を含む。特定の例示的sHASEGPおよびその使用方法は（rHuPH20を含む）、米国特許出願公開第2005/0260186号および第2006/0104968号に記載されている。一局面において、sHASEGPは、コンドロイチナーゼなどの1つまたは複数の追加的なグリコサミノグリカナーゼと組み合わせられる。

　例示的な凍結乾燥抗原結合分子製剤は、米国特許第6,267,958号に記載されている。水溶液抗原結合分子製剤は、米国特許第6,171,586号およびWO2006/044908に記載のものを含み、後者の製剤はヒスチジン－アセテート緩衝液を含んでいる。

　本明細書の医薬組成物または薬学的製剤は、治療される特定の適応症のために必要であれば1つより多くの有効成分を含んでもよい。互いに悪影響を与えあわない相補的な活性を伴うものが好ましい。このような有効成分は、意図された目的のために有効である量で、好適に組み合わせられて存在する。

　有効成分は、例えば液滴形成（コアセルベーション）手法によってまたは界面重合によって調製されたマイクロカプセル（それぞれ、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセル、およびポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル）に取り込まれてもよいし、コロイド状薬剤送達システム（例えば、リポソーム、アルブミン小球体、マイクロエマルション、ナノ粒子、およびナノカプセル）に取り込まれてもよいし、マクロエマルションに取り込まれてもよい。このような手法は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980) に開示されている。

　徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗原結合分子を含んだ固体疎水性ポリマーの半透過性マトリクスを含み、当該マトリクスは例えばフィルムまたはマイクロカプセルなどの造形品の形態である。

　生体内 (in vivo) 投与のために使用される製剤は、通常無菌である。無菌状態は、例えば滅菌ろ過膜を通して濾過することなどにより、容易に達成される。

　本明細書において引用したすべての文献は、参照により本明細書に組み入れられる。
　以下は、本開示の方法および組成物の実施例である。上述の一般的な記載に照らし、種々の他の態様が実施され得ることが、理解されるであろう。

[実施例1] CysおよびTCEPの2種の還元剤を用いた有効性確認
[概要]
　人工的なシステイン残基をFab領域に持つ抗原結合分子について、効率的に還元・酸化の反応を施すことで、ジスルフィド結合によりFabを架橋させ、LINCフォーマットの割合が高い抗体溶液を取得する方法を開発した。

[開発手法]
　細胞培養液(Harvested cell culture fluid: HCCF)からの一次精製として汎用的に用いられる手法「Protein Aアフィニティクロマトグラフィー」の中に、「還元溶液の通液→還元剤の除去及び酸化」の2つの工程を挿入することで、高収率かつ安定的にLINCフォーマットを得る手法を開発した。表６に、本発明の方法におけるProtein Aアフィニティクロマトグラフィーの各工程の詳細を示す。

[分析法]
　サンプル中でFabが架橋されてLINCフォーマットとなっている抗体の割合を、「LINC率」と定義した。
　LINC率の算出は、WO2021157679と同様に実施した。具体的には、非還元SDS-PAGEによって、架橋したLINCフォーマットと架橋していないunLINCフォーマット（オープン型）を分離させ、それぞれの存在比を比較した。

　非還元SDS-PAGEの手順は以下の通りである。
１）PBSで0.1 mg/mLまで希釈したサンプルを、試料用緩衝液 (2ME-)(×2)と等量に混合し、70℃で10分加熱した。
２）4% SDS-PAGEゲルに10 μLロードし、Tris/ Glycine/ SDSバッファー内で125 V, 90分泳動させた。
３）40% MeOH, 10% AcOHで10分間固定し、CBB溶液で1分染色、MilliQで10分脱色させた。
４）画像データの取得、および各バンドの定量化には、ChemiDoc Touch MP Imaging system (Bio-Rad社)を用いた。具体的には脱色後のゲルの画像データを、機器本体を用いて取得し、付属品の画像解析ソフトImageQuant LAS400を用いて各バンドを定量化した。

　Mab1（DUAL/LINC（1＋2）フォーマット、三価抗体、鎖1：配列番号：54、鎖2：配列番号：55、鎖3：配列番号：56、鎖4および5：配列番号：57）について、ProteinAカラム(MabSelect SuRe, 1 mL)に抗体の培養液を10 g/L resinになるように負荷し、表６の順序で溶液を通してクロマトグラフィーを実施した。

　なお、配列番号：54の1～22番目のアミノ酸残基、配列番号：55の1～19番目のアミノ酸残基、配列番号：56の1～19番目のアミノ酸残基、および配列番号：57の1～19番目のアミノ酸残基における配列は、発現シグナル配列である。LINC体では、鎖1のEUナンバリング191位のアミノ酸残基と鎖3のEUナンバリング191位のアミノ酸残基との間にジスルフィド結合が形成される。鎖1のEUナンバリング191位のアミノ酸残基は、配列番号：54における444番目のアミノ酸残基に対応する。鎖3のEUナンバリング191位のアミノ酸残基は、配列番号：56における221番目のアミノ酸残基に対応する。

　還元工程では、Cysteine (Cys)もしくはTris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)を含む溶液を通液した。それぞれの濃度、緩衝液組成、pHは表７の通りである。還元工程ではカラム通過時間12分の速度で溶液をカラム体積の10倍量流し、120分反応させた。

　還元剤除去/酸化工程では、酸化剤および還元剤を含まない25 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl pH7.7を通液した。カラム通過時間4分の速度で溶液をカラム体積の5倍量流し、20分反応させた。

[結果]
　結果、CysはpH 7.0, 8.0の環境下で濃度0.1-10 mmol/Lの濃度範囲でLINC率を向上させることが確認された（図１）。また、クロマトグラフィーとしての収率も還元酸化反応をスキップしたコントロール(92％)と同程度であることが確認された(85-104％)。
　また、TCEPの場合にも、還元剤濃度0.001-0.01 mmol/Lの条件でLINC率を向上させることが確認された（図２）。

[結論]
　本発明の方法は勘弁かつ迅速・高収率にLINCフォーマットを取得することができる手法であり、広い条件下(還元剤の種類は還元力が弱いCysから極めて強力なTCEPまで、還元剤濃度は1 μmol/L～100 mmol/Lまで、その他pH、反応時間なども広い範囲)で適応可能であることがわかった。

[実施例２] メンブレンクロマトグラフィーデバイスに対しての有効性確認
［概要］
　本手法がメンブレンクロマトグラフィーデバイスを用いたProtein Aアフィニティクロマトグラフィーにも適用可能であることを確認した。
［開発手法］
　表８に、本発明の方法におけるメンブレンProtein Aアフィニティクロマトグラフィーの各工程の詳細を示した。「還元溶液の通液→還元剤の除去及び酸化」の2つの工程を挿入することで、高収率かつ安定的にLINCフォーマットを得る手法を開発した。

[分析法]
　サンプル中でFabが架橋されてLINCフォーマットとなっている抗体の割合を、「LINC率」と定義した。
　FabALACTICA (Genovis製プロテアーゼIdgE)（抗体のアミノ酸配列KSCDKT/HTCPPCPにおいてTH間で消化するプロテアーゼ(/は消化サイトを示す)によりFabが架橋したLINC体は消化されないが、架橋していないunLINC体(Open form)は消化されるという分子の特徴を利用した。またプロテアーゼ処理後サンプルの分析には、キャピラリーSDSゲル電気泳動法(CE-SDS)および疎水性相互作用クロマトグラフィー法(HIC)を使用した。具体的には、以下の手順でサンプルの分析、LINC率の算出を行った。
１）抗体を含むサンプル溶液にプロテアーゼIdgEを添加した。
２）混合サンプルを37℃で18時間インキュベーションした。

CE-SDSによる分析の場合
３）酵素消化後のサンプル、酵素消化処理をしていないサンプル、および酵素のみを含むサンプルをCE-SDS法により分析した。
４）得られた(A)酵素のみを含むサンプル、(B)酵素消化処理をしていないサンプル、 (C)酵素消化後の各サンプルについて、electropherogramを用いて計算処理を行った。(C)から(A)、（B）を減算した(図４)。
５）４）において得られた減算後electropherogramにおいて検出される全てのピークエリアに対しLINC体由来のピークエリア割合を算出し、その値をLINC率とした。

　LINC率の計算式は以下の通りである。

HICによる分析の場合
３）酵素消化後のサンプルをHICにより分析した。HICに用いる移動相Aは20 mM リン酸バッファー, 1.5 M 硫酸アンモニウム、pH7.0、移動相Bは20 mM リン酸バッファー、pH7.0とした。液体クロマトグラフィーのグラジエントは移動相Bが2%から100%に15分で上昇するものとした。カラム温度は25±5℃、UV検出波長は220 nmとした。
４）得られたUVクロマトグラム上のピークエリアに対しLINC体由来のピークエリアの割合を算出し、その値をLINC率とした(図５参照)。

　LINC率の計算式は以下の通りである。
(LINC%) = (LINCの面積値)*100 / (Total)
(Total) = (LINCの面積値) + (unLINC-1の面積値) + (unLINC-2の面積値) + (unLINC-3の面積値) + (unLINC-4の面積値)

［メンブレンクロマトグラフィーに対しての有効性確認］
　Mab2（DUAL/LINC（1＋2）フォーマット、三価抗体、鎖1：配列番号：54、鎖2：配列番号：55、鎖3：配列番号：60、鎖4および5：配列番号：57）について、メンブレンクロマトグラフィーデバイス(Sartbind A, 1.2 mL)に抗体の培養液を25 g/L resinになるように負荷し、クロマトグラフィーを実施した。

　なお、配列番号：54の1～22番目のアミノ酸残基、配列番号：55の1～19番目のアミノ酸残基、配列番号：60の1～19番目のアミノ酸残基、および配列番号：57の1～19番目のアミノ酸残基における配列は、発現シグナル配列である。発現シグナル配列が除去されたMab2は、配列番号：45に記載のアミノ酸配列を有する鎖1、配列番号：40に記載のアミノ酸配列を有する鎖2、配列番号：44に記載のアミノ酸配列を有する鎖3、ならびに配列番号：42に記載のアミノ酸配列を有する鎖4および鎖5を有する。

　LINC体では、鎖1のEUナンバリング191位のアミノ酸残基と鎖3のEUナンバリング191位のアミノ酸残基との間にジスルフィド結合が形成される。鎖1のEUナンバリング191位のアミノ酸残基は、配列番号：54における444番目のアミノ酸残基、配列番号：45における422番目のアミノ酸残基に対応する。鎖3のEUナンバリング191位のアミノ酸残基は、配列番号：60における221番目のアミノ酸残基、配列番号：44における202番目のアミノ酸残基に対応する。

　還元工程では、0.15 mmol/Lの還元剤(Cys)を含む溶液を通液した。緩衝液組成は0.15 mmol/L L-Cysteine, 50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0, 溶液のデバイス通過時間は30秒で、デバイス体積の15倍量流し7.5分反応させた。

　還元剤除去/酸化工程では、酸化剤および還元剤を含まない25 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl pH7.7を通液した。デバイス通過時間３０秒で溶液をデバイス体積の15倍量流し、７．５分反応させた。

　結果、設定した条件下でLINC率を向上させることが確認された（表９）。また、クロマトグラフィーによる精製の収率も還元酸化反応をスキップしたコントロールと同程度であることが確認された。

[結論]
　本発明の方法は簡便かつ迅速・高収率にLINCフォーマットを取得することができる手法であり、カラムだけでなく、メンブレンの形態でのクロマトグラフィーにも適用可能であることが確認された。

　本開示における方法は、勘弁かつ迅速・高収率な、ヒンジ領域以外の領域に適切なジスルフィド結合を有する抗原結合分子の製造および精製において有用である。

Claims

　ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間で形成される少なくとも１つのジスルフィド結合を有する抗原結合分子を含む調製物の製造方法であって、還元剤存在下で、ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間で形成される少なくとも１つのジスルフィド結合を有する抗原結合分子と当該抗原結合分子のジスルフィド結合のミスマッチ体および／または形成不全体を含む混合物をクロマトグラフィーに供する工程を含む、方法。
　ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間で形成される少なくとも１つのジスルフィド結合を有する抗原結合分子を含む調製物の製造方法であって、以下の工程を含む、方法；
（ａ）クロマトグラフィー内で、ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間で形成される少なくとも１つのジスルフィド結合を有する抗原結合分子と当該抗原結合分子のジスルフィド結合のミスマッチ体および／または形成不全体を含む混合物と、還元剤とを接触させる工程、および
（ｂ）還元剤を除去する工程。
　抗原結合分子が２以上のポリペプチド鎖を含み、前記ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間で形成される少なくとも1つのジスルフィド結合がポリペプチド鎖間で形成されていることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
　前記ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基の片方もしくは双方が、変異、置換、または導入されたシステイン残基である、請求項３に記載の方法。
　前記クロマトグラフィーが、アフィニティクロマトグラフィー担体、イオン交換クロマトグラフィー担体、疎水性相互作用クロマトグラフィー担体、イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーの両方を含むマルチモードクロマトグラフィー担体、またはハイドロキシアパタイト担体を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
　アフィニティクロマトグラフィー担体が、プロテインＡ担体、プロテインＧ担体、プロテインＬ担体、配列選択的なペプチド担体、および抗原結合分子に選択的に結合する担体からなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
　イオン交換クロマトグラフィー担体が、陽イオン交換リガンド、または陰イオン交換リガンドである、請求項５に記載の方法。
　疎水性相互作用クロマトグラフィー担体が、疎水性リガンドである、請求項５に記載の方法。
　マルチモードクロマトグラフィー担体が、陽イオン交換リガンドと疎水性リガンドを組み合わせた担体、または陰イオン交換リガンドと疎水性リガンドを組み合わせた担体である、請求項５に記載の方法。
　ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー担体が、ハイドロキシアパタイトもしくはその転換体である、請求項５に記載の方法。
　前記クロマトグラフィーの担体が、カラムクロマトグラフィーのカラム内に充填または膜クロマトグラフィーの膜上に塗布されている、請求項５から１０のいずれか一項に記載の方法。
　還元剤がモノチオール、ジチオール、ホスフィン、および無機試薬、ならびにこれらの２以上の組み合わせからなる群より選択される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
　還元剤が、システインおよび／またはＴＣＥＰである、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
　還元剤がＴＣＥＰであり、かつ、還元剤の濃度が０．００００１ｍＭ～１０．０ｍＭである、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
　還元剤がシステインであり、還元剤の濃度が０.０１ｍＭ～１００ｍＭである、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
　還元剤の除去が、抗原結合分子と還元剤を含まない溶液とを接触させることを含む、請求項２から１５のいずれか一項に記載の方法。
　抗原結合分子が、少なくとも１つのジスルフィド結合を介して互いに連結されることができる第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインを含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
　前記ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間で形成される少なくとも1つのジスルフィド結合が第一の抗原結合ドメインと第二の抗原結合ドメインとの間で形成されている、請求項１７に記載の方法。
　前記ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間で形成される少なくとも1つのジスルフィド結合が第一の抗原結合ドメインの重鎖と第二の抗原結合ドメインの重鎖との間で形成されている、請求項１７または１８に記載の方法。
　前記ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間で形成される少なくとも1つのジスルフィド結合が第一の抗原結合ドメインのCH1領域と第二の抗原結合ドメインのCH1領域との間で形成されている、請求項１７から１９のいずれか一項に記載の方法。
　前記ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間で形成される少なくとも1つのジスルフィド結合が第一の抗原結合ドメインの重鎖のEUナンバリング191位のアミノ酸残基と第二の抗原結合ドメインの重鎖のEUナンバリング191位のアミノ酸残基との間で形成されている、請求項１７から２０のいずれか一項に記載の方法。
　第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインが、それぞれ、細胞表面上に存在するタンパク質である第一の抗原および第二の抗原に結合し、かつ抗原結合分子が、第一の抗原を発現する細胞と第二の抗原を発現する細胞との間の相互作用を促進する活性を有する、請求項１７から２１のいずれか一項に記載の方法。
　第一の抗原を発現する細胞が細胞傷害活性を有する細胞であり、第二の抗原を発現する細胞がその標的となる細胞であり、かつ抗原結合分子が、前記細胞傷害活性を有する細胞による前記標的細胞の損傷を促進する、請求項２２に記載の方法。
　細胞傷害活性を有する細胞がＴ細胞、ＮＫ細胞、単球、またはマクロファージである、請求項２３に記載の方法。
　第一の抗原および第２の抗原が、サイトカイン受容体スーパーファミリーに属する受容体、Ｇタンパク質結合型受容体、イオンチャネル型受容体、チロシンキナーゼ型受容体、免疫チェックポイント受容体、抗原受容体、ＣＤ抗原、共刺激分子、および細胞接着分子からなる群より独立に選択される、請求項２２から２４のいずれか一項に記載の方法。
　第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインがそれぞれ、ＣＤ３および／またはＣＤ１３７に結合することができる、請求項１７から２５のいずれか一項に記載の方法。
　抗原結合分子が、第三の抗原結合ドメインをさらに含む、請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法。
　第三の抗原結合ドメインが、第一の抗原結合ドメインまたは第二の抗原結合ドメインのいずれか一方に融合されている、請求項２７に記載の方法。
　第三の抗原結合ドメインがＦａｂまたはｓｃＦｖである、請求項２７または２８に記載の方法。
　第三の抗原結合ドメインが、そのＣ末端で、第一の抗原結合ドメインまたは第二の抗原結合ドメインのいずれか一方のＦａｂ重鎖（ＶＨ領域）のＮ末端に、任意でペプチドリンカーを介して、融合されている、請求項２７から２９のいずれか一項に記載の方法。
　第一の抗原結合ドメイン、第二の抗原結合ドメイン、および第三の抗原結合ドメインのそれぞれがＦａｂ分子であり、第三の抗原結合ドメインが、そのＦａｂ重鎖（ＣＨ１領域）のＣ末端で、第一の抗原結合ドメインまたは第二の抗原結合ドメインのいずれか一方のＦａｂ重鎖（ＶＨ領域）のＮ末端に、任意でペプチドリンカーを介して、融合されている、請求項２７から３０のいずれか一項に記載の方法。
　ペプチドリンカーが、配列番号：18、配列番号：19、および配列番号：20に記載のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３０または３１に記載の方法。
　第三の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ軽鎖およびＦａｂ重鎖の可変領域が交換されているクロスオーバーＦａｂ分子であり、かつ第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインが従来型のＦａｂ分子である、請求項２７から３２のいずれか一項に記載の方法。
　第三の抗原結合ドメインが、がん細胞またはがん組織上に発現している抗原に結合することができる、請求項２７から３３のいずれか一項に記載の方法。
　第三の抗原結合ドメインが、ＤＬＬ３、好ましくはヒトＤＬＬ３に結合できる、請求項２７から３４のいずれか一項に記載の方法。
　抗原結合分子がＦｃ領域をさらに含む、請求項１から３５のいずれか一項に記載の方法。
　第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのそれぞれが、同じかまたは異なり得る抗体可変領域を含み、かつ、以下の（a1）～（a4）：
（a1）配列番号：27に記載のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域（CDR）1、
　　　配列番号：28に記載のアミノ酸配列を含む重鎖CDR 2、および
　　　配列番号：29に記載のアミノ酸配列を含む重鎖CDR 3
　　　を含む重鎖可変領域、および、
　　　配列番号：30に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR 1、
　　　配列番号：31に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR 2、および
　　　配列番号：32に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR 3
　　　を含む軽鎖可変領域
　　　を含む、抗体可変領域；
（a2）配列番号：33に記載のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域（CDR）1、
　　　配列番号：34に記載のアミノ酸配列を含む重鎖CDR 2、および
　　　配列番号：35に記載のアミノ酸配列を含む重鎖CDR 3
　　　を含む重鎖可変領域、および、
　　　配列番号：30に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR 1、
　　　配列番号：31に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR 2、および
　　　配列番号：32に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR 3
　　　を含む軽鎖可変領域
　　　を含む、抗体可変領域；
（a3）（a1）または（a2）に記載の抗体可変領域が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体可変領域；ならびに
（a4）（a1）または（a2）に記載の抗体可変領域と抗原に対する結合が競合する抗体可変領域
からなる群より独立して選択される抗体可変領域を含む、請求項１７から３６のいずれか一項に記載の方法。
　第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのそれぞれが、同じかまたは異なり得る抗体可変領域を含み、かつ、以下の（a1）～（a4）：
（a1）配列番号：36に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および、
　　　配列番号：37に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
　　　を含む、抗体可変領域；
（a2）配列番号：38に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および、
　　　配列番号：37に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
　　　を含む、抗体可変領域；
（a3）（a1）または（a2）に記載の抗体可変領域が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体可変領域；ならびに
（a4）（a1）または（a2）に記載の抗体可変領域と抗原に対する結合が競合する抗体可変領域
からなる群より独立して選択される抗体可変領域を含む、請求項１７から３７のいずれか一項に記載の方法。
　第三の抗原結合ドメインが、以下の（a1）～（a4）：
（a1）配列番号：46に記載のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域（CDR）1、
　　　配列番号：47に記載のアミノ酸配列を含む重鎖CDR 2、および
　　　配列番号：48に記載のアミノ酸配列を含む重鎖CDR 3
　　　を含む重鎖可変領域、および、
　　　配列番号：49に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR 1、
　　　配列番号：50に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR 2、および
　　　配列番号：51に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR 3
　　　を含む軽鎖可変領域を含む、
　　　抗体可変領域；
（a2）配列番号：52に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および、
　　　配列番号：53に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
　　　を含む、抗体可変領域；
（a3）（a1）または（a2）に記載の抗体可変領域が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体可変領域；ならびに
（a4）（a1）または（a2）に記載の抗体可変領域と抗原に対する結合が競合する抗体可変領域
からなる群より独立して選択される抗体可変領域を含む、請求項２７から３８のいずれか一項に記載の方法。
　第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのそれぞれが、
配列番号：27に記載のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域（CDR）1、
配列番号：28に記載のアミノ酸配列を含む重鎖CDR 2、および
配列番号：29に記載のアミノ酸配列を含む重鎖CDR 3
を含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号：30に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR 1、
配列番号：31に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR 2、および
配列番号：32に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR 3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体可変領域を含む、請求項１７から３９のいずれか一項に記載の方法。
　第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのそれぞれが、
配列番号：36に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
配列番号：37に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体可変領域を含む、請求項１７から４０のいずれか一項に記載の方法。
　第三の抗原結合ドメインが、
配列番号：46に記載のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域（CDR）1、
配列番号：47に記載のアミノ酸配列を含む重鎖CDR 2、および
配列番号：48に記載のアミノ酸配列を含む重鎖CDR 3
を含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号：49に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR 1、
配列番号：50に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR 2、および
配列番号：51に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR 3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体可変領域を含む、請求項２７から４１のいずれか一項に記載の方法。
　第三の抗原結合ドメインが、
配列番号：52に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
配列番号：53に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体可変領域を含む、請求項２７から４２のいずれか一項に記載の方法。
　第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのそれぞれが、
配列番号：36のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
配列番号：37のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体可変領域を含み、かつ、
　第三の抗原結合ドメインが、
配列番号：52を含む重鎖可変領域、および
配列番号：53を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体可変領域を含む、請求項２７から４３のいずれか一項に記載の方法。
　第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインのそれぞれが、重鎖のEUナンバリング191位にシステイン残基を有するFabであり、かつ2つのシステイン残基によって形成されたジスルフィド結合を有する、請求項１７から４４のいずれか一項に記載の方法。
　抗原結合分子が、
（a1）配列番号：39に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、
　　　配列番号：40に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、
　　　配列番号：41に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および
　　　配列番号：42に記載のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4および鎖5）；
（a2）配列番号：43に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、
　　　配列番号：40に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、
　　　配列番号：44に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および
　　　配列番号：42に記載のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4および鎖5）；ならびに
（a3）配列番号：45に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、
　　　配列番号：40に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、
　　　配列番号：44に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および
　　　配列番号：42に記載のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4および鎖5）；
からなる群より選択される組み合わせのいずれか1つにおける5本のポリペプチド鎖を含み、好ましくは、5本のポリペプチド鎖（鎖1～鎖5）が、図３に示される配向性に従って相互に連結および/または会合される、請求項１から４５のいずれか一項に記載の方法。
　請求項１から４６のいずれか一項に記載の方法により製造された、ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間で形成される少なくとも１つのジスルフィド結合を有する抗原結合分子を含む調製物。
　請求項１から４６のいずれか一項に記載の方法により製造された、ヒンジ領域以外の領域におけるアミノ酸残基間で形成される少なくとも１つのジスルフィド結合を有する抗原結合分子を含む調製物を含む、医薬組成物。