Quarenta e dois dos sessenta cardeais entraram no conclave. O conclave começou no Vaticano em 21 de abril, Domingo de Páscoa. Na cerimônia de abertura, dos sessenta cardeais vivos trinta e nove estavam presentes. Três chegaram mais tarde, a tempo de votar: André de Áustria, Ludovico Madruzzo de Trento e Guido Luca Ferraro de Vercelli. Duas facções se formaram. A primeira foi liderada pelo cardeal Ferdinando de' Médici e o segundo por Luigi d'Este (neto do rei Luís XII da França). Eles estavam dispostos a se combinar para fazer o papa, mas dependia esse acordo de se chegar a um nome de consenso.
A primeira votação parecia favorecer os cardeais Pier Donato Cesi e Guglielmo Sirleto, mas na manhã seguinte, eles tinham sido abandonados. Querendo evitar a influência potencial de cardeais que ainda não tinha chegado, Médici, em seguida, propôs dois nomes para d'Este: os Cardeais Albani e Montalto, e convidou-o a escolher. D'Este impôs condições, no entanto, o acordo projetado, quando a notícia saiu, causou muita indignação. Através de uma série de informações errôneas e estratagemas, Médici convenceu aos cardeais que Montalto não era o seu candidato.
O cardeal Ludovico Madruzzo, que era o líder designado da facção espanhola, chegou a Roma e teve conversas com os embaixadores de Espanha e do Sacro Império, antes que entrar no conclave. Encontro-se imediatamente com d 'Este, soube que d' Este não gostava de seu próprio favorito, cardeal Sirleto. Considerando que um papa completamente pró-espanhol seria tão intragável como um completamente pró-francês, ele declarou-se, portanto, para d'Este ser contra o cardeal Albani, e, portanto, em favor de Montalto. Altemps, Médici e Gesualdo, em seguida, pressionaram Madruzzo e ele foi conquistado. Como líder do interesse espanhol, ele trouxe a sua própria influência para carregar André da Áustria, Colonna, Deza (Seza), Gonzaga, Sfondrati e Spínola. Com todos esses adeptos, Médici e d'Este ainda necessitavam de quatro votos. Estes só poderia ser obtido no grupo de cardeais criados por Gregório XIII, organizado por Alessandro Farnese, o Decano do Colégio Cardinalício. Durante aquela noite, o Cardeal Ferrero chegou.
Em 24 de abril, Médici explicou para Montalto tudo o que tinha sido feito, e aconselhou-o sob a forma de como conduzir a reunião. D'Este reuniu-se com Farnese, que acreditava que Montalto não teria votos, e conseguiu enganá-lo. Durante uma reunião na Capela Paulina, d'Este recrutou a Vastavillani, Cardeal Camerlengo, Giovanni Battista Castagna, o Cardeal de San Marcello, e Francesco Sforza. Quando finalmente os cardeais estavam reunidos na Capela Sistina, d'Este declarou que não era necessário proceder a uma votação, já que era óbvio que o novo papa estava ali. Sem oposição dos cardeais passou a fazer uma homenagem ("Adoração") para Montalto embora, logo depois, a votação fosse realizada para pedir a cada cardeal para lançar seu voto em voz alta. A votação foi unânime. O cardeal François de Joyeuse chegou a Roma tarde demais para participar do Conclave.
Eleito Montalto, este escolheu o nome de Papa Sisto V.