Article 

Synergistic Activity of Nitroimidazole‐Oxazolidinone 
Conjugates against Anaerobic Bacteria 
Zhijun Zhuang 1, Dawei Wan 1, Jun Ding 1, Shijie He 1, Qian Zhang 1, Xiaomei Wang 1, Ying Yuan 1, 
Yu Lu 2, Charles Z. Ding 3, Anthony Simon Lynch 4, Anna M. Upton 5, Christopher B. Cooper 5, 
William A. Denny 6 and Zhenkun Ma 1,* 
1  TenNor Therapeutics Limited, 218 Xinghu Street, Building B2, Suite 711, Suzhou Industrial Park,   
Suzhou 215123, China; zhijun.zhuang@tennorx.com (Z.Z.); dawei.wan@tennorx.com (D.W.); 
jun.ding@tennorx.com (J.D.); shijie.he@tennorx.com (S.H.); qian.zhang@tennorx.com (Q.Z.); 
xiaomei.wang@tennorx.com (X.W.); ying.yuan@tennorx.com (Y.Y.) 
2  Department of Pharmacology, Beijing Tuberculosis and Thoracic Tumor Research Institute,   

Beijing Chest Hospital, Capital Medical University, 97 Ma Chang Street, Beijing 101149, China; 
luyu4876@hotmail.com 
3  WuXi AppTec. Co. Ltd., 288 Fute Zhong Road, Waigaoqiao Free Trade Zone, Shanghai 200131, China; 

charles_ding@wuxiapptec.com 
4  Janssen Research & Development LLC., 1400 McKean Road, Spring House, PA 18940, USA; 

alynch2@its.jnj.com 
5  Global Alliance for TB Drug Development, 40 Wall Street, New York, NY 10005, USA; 

anna.upton@tballiance.org (A.M.U.); christopher.cooper@tballiance.org (C.B.C.) 
6  Auckland Cancer Society Research Centre, School of Medical Sciences, University of Auckland,   

Private Bag 92019, Auckland 1142, New Zealand; b.denny@auckland.ac.nz 
*  Correspondence: zhenkun.ma@tennorx.com; Tel.: +86‐512‐8686‐1980 

Academic Editors: Larry Wakelin and Sandra Gemma 
Received: 8 May 2020; Accepted: 19 May 2020; Published: 22 May 2020 

Abstract:  The  introductions  of  the  bicyclic  4‐nitroimidazole  and  the  oxazolidinone  classes  of 
antimicrobial agents represented the most significant advancements in the infectious disease area 
during  the  past  two  decades.  Pretomanid,  a  bicyclic  4‐nitroimidazole,  and  linezolid,  an 
oxazolidinone, are also part of a combination regimen approved recently by the US Food and Drug 
Administration  for  the  treatment  of  pulmonary,  extensively  drug  resistant  (XDR), 
treatment‐intolerant or nonresponsive multidrug‐resistant (MDR) Mycobacterium tuberculosis (TB). 
To identify new antimicrobial agents with reduced propensity for the development of resistance, a 
series  of  dual‐acting  nitroimidazole‐oxazolidinone  conjugates  were  designed,  synthesized  and 
evaluated  for  their  antimicrobial  activity.  Compounds  in  this  conjugate  series  have  shown 
synergistic  activity  against  a  panel  of  anaerobic  bacteria,  including  those  responsible  for  serious 
bacterial infections. 

Keywords: drug conjugates; anaerobic bacterium; synergy; nitroimidazole and oxazolidinone 
 

1. Introduction 
Oxazolidinones, as represented by linezolid (1) and tedizolid (2), and bicyclic 4‐nitroimidazoles, 
as represented by pretomanid (3) and delamanid (4), are two relatively new classes of antimicrobial 
agents (Figure 1). Linezolid, the first oxazolidinone approved for clinical use, was introduced in 2000 
for  the  treatment  of  Gram‐positive  bacterial  infections,  including  those  that  are  resistant  to  other 
classes of antibiotics [1]. This drug class inhibits bacterial protein synthesis by binding to rRNA on 
both  the  30S  and  50S  ribosomal  subunits  and  preventing  the  formation  of  a  translation  initiation 
Molecules 2020, 25, 2431; doi:10.3390/molecules25102431  www.mdpi.com/journal/molecules 
Molecules 2020, 25, 2431  2  of  14 

complex. The first bicyclic 4‐nitroimidazole, delamanid, was introduced in 2014 for the treatment of 
drug‐resistant  tuberculosis  (TB).  This  drug  class  utilizes  a  deazaflavin‐dependent  nitroreductase 
(Ddn)  to  catalyze  the  bioreduction  of  the  4‐nitroimidazole  core,  leading  to  the  intracellular 
generation of reactive chemical species which are toxic to bacterial cells [2]. However, the primary 
mechanism  of  action  of  the  bicyclic  4‐nitroimidazole  class  against  M.  tuberculosis  appeared  to  be 
different under aerobic and anaerobic conditions. Inhibition of mycolic acid synthesis appeared to be 
the main mechanism under aerobic conditions, while the generation of reactive nitrogen species and 
inhibition of energy metabolism appeared to be the main mechanism under anaerobic conditions [3]. 

Figure 1. Structures of Linezolid, Tedizolid, Pretomanid, Delamanid and Conjugate Molecule 5. 

Resistance to oxazolidinones and bicyclic 4‐nitroimidazoles is relatively uncommon. Both drug 
classes  have  been  used  for  the  treatment  of  multidrug‐resistant  (MDR)  and  extensively  drug 
resistant (XDR)  TB. Recently,  a  three‐drug  combination  containing  both  pretomanid  and  linezolid 
was  approved  by  the  US  Food  and  Drug  Administration  for  the  treatment  of  pulmonary  XDR, 
treatment‐intolerant or nonresponsive MDR‐TB [4]. 
Previously,  a  drug  conjugation  strategy  was  utilized  to  identify  the  dual‐acting  molecule 
TNP‐2092  for  the  treatment  of  bacterial  biofilm  infections  [5].  This  strategy  provides  several 
advantages  compared  to  drug  combination  therapy,  including  matched  pharmacokinetics,  tissue 
distribution and potential synergistic activity. Considering the importance of the oxazolidinone and 
the  bicyclic 4‐nitroimidazole  classes,  a  series  of  oxazolidinone‐nitroimidazole  conjugate  molecules 
was designed, synthesized and evaluated. 

2. Results and Discussion 

2.1. Chemistry 
The  safety  and  efficacy  of  the  oxazolidinone  and  bicyclic  4‐nitroimidazole  classes  have  been 
validated  clinically.  The  structure–activity  relationships  (SARs)  of  both  drug  classes  have  been 
extensively  studied  in  the  past,  which  serve  as  the  foundation  for  the  design  of  the  conjugation 
molecules. 
As  a  protein  synthesis  inhibitor,  linezolid  utilizes  hydrogen  bonding  and  hydrophobic 
interactions to bind to a binding domain located within the ribosomal peptidyltransferase center. A 
high resolution analysis of the of crystal structure of linezolid bound to the 50S ribosomal subunit 
indicated that the oxazolidinone ring and the acetamide group on the right side of the molecule are 
essential  for  the  target  interactions.  The  fluorophenyl  moiety  in  the  middle  is  also  important. 
However, the morpholino ring on the left side does not appear to have significant interactions with 
the  binding  site,  which  is  consistent  with  known  SARs  whose  various  structures  can  be  used  to 
Molecules 2020, 25, 2431  3  of  14 

substitute the morpholine group without significant loss of activity [6]. This position was therefore 
identified as the linking point for conjugation to a bicyclic 4‐nitroimidazole core. 
On the bicyclic 4‐nitroimidazole side, the nitroimidazole group and its fused oxazine or oxazole 
ring  are  essential  and  directly  responsible  for  the  formation  of  intracellular  reactive  species  via  a 
bioreduction process.  The stereochemistry  of the  substituents connected to the  oxazine or  oxazole 
ring  also  plays  an  important  role  for  the  antimicrobial  activity.  However,  the  structure  of  the 
substituents  on  the  right‐hand  side  are  highly  variable,  and  can  tolerate  many  functional  groups. 
This site was hence identified as the linking point for the bicyclic 4‐nitroimidazole class. 
A  series  of  drug  conjugate  was  therefore  designed  and  synthesized  by  connecting  the 
right‐hand  side  of  the  bicyclic  4‐nitroimidazole  and  the  left‐hand  side  of  the  oxazolidinone  core 
through various linkers. The syntheses of these conjugate molecules are illustrated in Scheme 1–3. 
Compound  5  (Figure  1)  is  a  previously  known  oxazolidinone‐metronidazole  conjugate;  it  has  not 
been evaluated for its activity against M. tuberculosis or anaerobic organisms [7]. Compound 5 was 
also prepared in the current study and its activity against M. tuberculosis isogenic mutant panel and 
anaerobic bacterial panel was evaluated. 

Scheme 1. Synthesis of Conjugate Molecules 8a–b and 11a–b. 

The syntheses of the conjugate molecules formed by the oxazine fused nitroimidazole and the 
oxazolidinone  core  8a–b  and  11a–b  are  summarized  in  Scheme  1.  The  known 
(S)‐2‐nitro‐6,7‐dihydro‐5H‐imidazo[2,1‐b][1,3]oxazin‐6‐ol  core  (6)  was  prepared  according  to 
literature procedures [8]. Intermediates 7a–b and 10a–b were prepared by aromatic or nucleophilic 
substitution  reaction.  Suzuki  coupling  with  the  oxazolidinone  piece  9a  or  9b  provided  conjugate 
molecules 8a–b and 11a–b. 
Molecules 2020, 25, 2431  4  of  14 

Scheme 2. Synthesis of Conjugate Molecules 14a–d and 16. 

The syntheses of the conjugate molecules formed by the oxazole‐fused nitroimidazole and the 
oxazolidinone  core  14a–d  and  16  are  summarized  in  Scheme  2.  The  known  racemate 
2‐bromo‐1‐((2‐methyloxiran‐2‐yl)methyl)‐4‐nitro‐1H‐imidazole  (12)  was  prepared  according  to  a 
method  described  in  the  literature  [9].  Intermediate  13a–d  were  prepared  by  epoxide  opening 
followed  by  intramolecular  cyclization.  Suzuki  or  copper‐catalyzed  coupling  provided 
diastereomeric  conjugate  molecules  14a–d  and  16.  The  ratio  of  the  two  diastereomers  was  not 
determined due to the fact that the two chiral centers in the molecules were distant from each other, 
and the two diastereomers could not be distinguished from each other spectroscopically.   

Scheme 3. Synthesis of Conjugate Molecules 19a–c. 

Scheme 3 summarizes the syntheses of a third series of conjugate molecules 19a–c. This series 
contains  the  same  oxazine  fused  nitroimidazole  core  as  shown  in  Scheme  1,  but  connects  to  the 
oxazolidinones  via  a  different  linking  point.  The  known  racemate  intermediates 
(2‐nitro‐6,7‐dihydro‐5H‐imidazo[2,1‐b][1,3]oxazin‐7‐yl)methanol  (17a)  and 
(7‐methyl‐2‐nitro‐6,7‐dihydro‐5H‐imidazo[2,1‐b][1,3]oxazin‐7‐yl)methanol  (17b)  were  prepared 
according  to  a  procedure  described  in  the  literature  [10].  Aromatic  substitution  provided 
intermediates 18a–c. Suzuki coupling with the oxazolidinone precursor 9a provided diastereomeric 
conjugate molecules 19a–c. 

2.2. Mechanism of Action 
The  mechanisms  of  action  of  the  precursor  antibiotics  of  the  conjugate  molecules  are  well 
established.  In  order  to  understand  whether  the  conjugate  molecules  synthesized  in  the  current 
study maintained antibacterial activity and were enhanced by both precursor antibiotic classes, an 
isogenic panel of resistant mutant strains was prepared from wild‐type strain M. tuberculosis H37Rv 
Molecules 2020, 25, 2431  5  of  14 

by stepwise resistance induction with linezolid or pretomanid (Table 1). Resistant mutant strains L1 
and L3 were induced by linezolid with mutations on rplC gene encoding the 50S ribosomal protein 
L3. The minimum inhibitory concentrations (MICs) of linezolid against L1 and L3 were 4.80 and 8.18 
μg/mL, respectively, as compared to 0.15 μg/mL against the wild‐type H37Rv strain. The resistant 
mutant strains P1 and P3 were induced by pretomanid with mutations in the ddn gene encoding the 
deazoflavin‐dependent nitroreductase. The MICs of pretomanid against P1 and P3 strains were >20 
and >20 μg/mL respectively, as compared to 0.07 μg/mL for the H37Rv strain. 
All four conjugate compounds listed in Table 1 (8a, 8b, 14c and 14d) were highly active against 
the  H37Rv  strain  with  MICs  similar  to  those  of  linezolid  and  pretomanid.  More  importantly,  all 
compounds  were  significantly  more  potent  than  linezolid  against  the  L1  and  L3,  strains  and 
significantly more potent than pretomanid against the P1 and P3 mutant strains, indicating that the 
antimicrobial  activity  of  the  conjugate  molecules  benefits  from  contributions  from  both  parental 
antibiotic pharmacophores. 
Compounds 8a and 8b were formed by oxazine‐fused 4‐nitroimidazole and the oxazolidinone 
core. These compounds, particularly compound 8a, appeared to be more potent against the linezolid 
resistant  strains  L1  and  L3  than  the  pretomanid  resistant  strains  P1  and  P3,  suggesting  that  the 
4‐nitroimidazole function contributes relatively more significantly to the antibacterial activity than 
the  oxazolidonone  function  in  these  conjugate  molecules.  However,  compounds  14c  and  14d, 
formed by the oxazole fused 4‐nitroimidazole and the oxazolidinone core, demonstrated balanced 
activity against the linezolid resistant strains L1 and L3 and the pretomanid resistant strains P1 and 
P3, suggesting that these conjugate molecules exhibit a balanced contribution from the two parental 
antibiotic pharmacophores. 

Table  1.  Minimum  inhibitory  concentrations  of  selected  conjugate  molecules  against  isogenic 
resistant mutant strains of M. tuberculosis. 

M. tuberculosis Isogenic Mutant Panel MIC (μg/mL) 
Compounds 
H37Rv  L1  L3  P1  P3 
Linezolid  0.15  4.80  8.18  0.29  0.31 
Pretomanid  0.07  0.15  0.24  >20  >20 
8a  0.06  1.95  1.78  6.48  5.96 
8b  0.20  0.91  1.87  1.04  3.30 
14c  0.08  1.84  0.81  1.77  1.80 
14d  0.33  1.88  1.46  1.93  2.94 

2.3. Spectrum of Activity 
Selected  compounds  from  the  current  study  were  tested  against  a  panel  of  representative 
pathogens (Table 2). All eight conjugate compounds tested showed a similar spectrum of activity as 
linezolid  against  the  ESKAPE  pathogens:  Enterococcus  faecium  (Ef),  Staphylococcus  aureus  (Sa), 
Klebsiella pneumoniae (Kp), Acinetobacter baumannii (Ab), Pseudomonas aeruginosa (Pa), and Escherichia 
coli (Ec). Specifically, these compounds were active against Ef and Sa, but inactive against Kp, Ac, Pa 
and  Ec  strains.  Several  compounds  (8a,  8b,  11a  and  14c)  were  substantially  more  active  than 
linezolid against Ef and Sa. All conjugate compounds were substantially more active than linezolid 
against the obligate anaerobic pathogen Clostridium difficile (Cd). The activities of these compounds 
were  similar  to  those  of  metronidazole.  Compound  11a,  with  an  acetamido  group  at  the 
oxazolidinone  ring, appeared  to  be  more  active than  its  hydroxyl  counterpart  11b  against  aerobic 
bacteria  Ef  and  Sa.  However,  11a  was  similar  or  slightly  less  active  than  11b  against  anaerobic 
bacterium  Cd.  The  different  SARs  between  these  two  compounds  against  aerobic  and  anaerobic 
bacteria could be a result of the different mechanisms of action. In an aerobic bacterium, the activity 
is  driven  by  the  oxazolidinone  pharmacophore,  while  in  anaerobic  bacteria,  the  activity  is  mainly 
driven  by  the  nitroimidazole  pharmacophore.  The  conjugate  compounds  were  not  cytotoxic,  with 
IC50s > 64 μg/mL for all compounds tested against the Vero cell‐line. 
 Molecules 2020, 25, 2431  6  of  14 

Table  2.  Minimum  inhibitory  concentrations  (MIC)  of  selected  conjugate  molecules  against 
representative strains from seven major pathogen classes. 

Representative of Major Pathogens MIC (μg/mL) 
Vero 
Ef  Sa  Kp  Ab  Pa  Ec  Cd 
Compounds  IC50 
ATCC  ATCC  ATCC  ATCC  ATCC  ATCC  ATCC 
μg/mL 
708221  29213  43816  19606  27853  25922  43255 
Linezolid  4  8  >64  >64  >64  >64  4  >64 
Levofloxacin  >16  0.25  0.063  0.5  1  <0.016  4  ‐ 
Metronidazole  >64  64  >64  >64  >64  >64  0.25  ‐ 
8a  0.5  1  >64  >64  >64  >64  0.125  >64 
8b  2  2  >64  >64  >64  >64  0.25  >64 
11a  1  2  >64  >64  >64  >64  0.25  ‐ 
11b  4  8  >64  >64  >64  >64  0.125  >64 
14a  4  4  >64  >64  >64  >64  0.25  >64 
14b  8  16  >64  >64  >64  >64  0.5  >64 
14c  1  2  >64  >64  >64  >64  0.125  >64 
14d  4  4  >64  >64  >64  >64  0.5  >64 

2.4. Anaerobic Activity 
The  promising  activity  of  the  4‐nitromidazole‐oxazolidinone  conjugate  series  against  the 
anaerobic  pathogen  C.  difficile  encouraged  us  to  explore  a  broader  panel  of  clinically  important 
anaerobic bacteria (Table 3). The test panel included 13 strains of anaerobic bacteria and Helicobacter 
pylori (Hp), a Gram‐negative microaerophilic bacterium. Seven of the 13 anaerobic bacterial strains 
were  Gram‐positive  and  the  rest  were  Gram‐negative.  The  full  names  of  the  anaerobic  bacterial 
panel strains are listed in Table 4. 

Table  3.  Minimum  inhibitory  concentrations  (MIC)  of  12  conjugate  molecules  against  clinically 
important anaerobic and microaerophilic bacterial strains. 
Anaerobic and Microaerophilic Bacterial Panel, MIC (ug/mL) 
Micro‐ 
Gram‐Positive  Gram‐Negative 
Compounds  Aerophilic 
Cd  La  El  Gv  Pm  Pas  Pac  Bf  Bl  Fn  Mm  Pv  Vp  Hp 
ATCC  ATCC  ATCC  ATCC  ATCC  ATCC  ATCC  ATCC  ATCC  ATCC  ATCC  ATCC  ATCC  ATCC 
700057  4356  43055  14018  23195  3553  11829  25285  15707  10953  35243  29303  17745  43504 
Metronidazole  ≤0.25  >256  0.5  2  >256  0.5  >256  ≤0.25  4  ≤0.25  8  2  >256  64 
Pretomanid (P)  2  >32  8  >32  >32  2  >32  16  >32  4  >32  32  >32  16 
Linezolid (L)  0.5  2  1  0.25  1  0.5  0.06  2  0.5  0.25  0.12  2  0.5  8 
L + P (1:1)  1  4  2  0.5  2  1  0.25  4  2  1  0.25  4  1  16 
5  0.06  NA  0.06  0.12  0.25  0.06  1  0.25  0.5  0.06  0.25  0.5  1  ‐ 
8a  ≤0.03  0.5  ≤0.03  0.06  0.12  0.06  ≤0.03  1  0.25  ≤0.03  ≤0.03  4  0.25  0.5 
8b  ≤0.03  0.5  ≤0.03  0.06  0.25  ≤0.03  0.06  4  0.12  ≤0.03  0.06  8  0.25  1 
11a  0.12  0.5  0.06  0.06  0.5  0.06  0.06  2  0.25  0.06  0.06  4  0.25  2 
11b  0.06  2  0.06  0.12  1  ≤0.03  0.12  4  0.25  ≤0.03  0.25  8  1  2 
14a  0.25  1  0.12  0.12  0.5  0.12  0.12  1  0.25  0.12  0.25  16  0.5  2 
14b  0.5  2  0.12  0.25  1  0.25  0.25  4  0.5  1  0.5  >32  1  8 
14c  0.06  0.5  ≤0.03  0.12  0.5  ≤0.03  0.06  0.5  0.25  ≤0.03  0.12  8  0.25  1 
14d  0.25  2  0.12  0.12  1  0.12  0.25  8  0.5  0.12  0.25  16  0.5  1 
16  4  >32  16  >32  >32  8  >32  >32  >32  >32  >32  >32  >32  16 
19a  ≤0.03  0.25  ≤0.06  0.06  0.12  ≤0.03  ≤0.03  0.12  0.06  ≤0.03  0.06  2  0.25  0.25 
19b  ≤0.03  0.5  0.06  0.06  0.12  ≤0.03  0.06  1  0.06  ≤0.03  0.06  4  0.25  0.25 
19c  ≤0.03  0.25  ≤0.03  ≤0.03  0.06  ≤0.03  ≤0.03  0.5  0.12  ≤0.03  0.06  2  0.25  0.5 

Metronidazole,  a  5‐nitroimidazole,  is  one  of  the  most  important  drugs  for  the  treatment  of 
anaerobic bacterial infections. The activity of metronidazole against this panel was inconsistent, with 
virtually  no  activity  against  Lactobacillus  acidophilus  (La),  Peptostreptococcus  micros  (Pm), 
Propionibacterium acnes (Pas) and Veillonella parvula (Vp). Pretomanid, a 4‐nitroimidazole, exhibited a 
similar  spectrum  of  activity  as  metronidazole  against  this  panel,  but  with  higher  MICs.  Linezolid 
Molecules 2020, 25, 2431  7  of  14 

was active against all the strains, with MICs ranging from 0.06 to 2 μg/mL against the 13 anaerobic 
bacteria. Interestingly, the 1:1 combination of linezolid and pretomanid was about one dilution less 
active than linezolid, virtually reflecting the activity of linezolid in the mixture. Pretomanid did not 
appear to contribute to the activity of the combination. 
Compound 5, a conjugate molecule between linezolid and metronidazole, a 5‐nitroimidazole, 
appeared  to  be  more  potent  than  either  of  its  precursor  antibiotics  against  all  strains  tested,  with 
MICs  ranging  from  0.06  to  1  μg/mL.  The  apparent  synergistic  effect  of  the 
4‐nitroimidazole‐oxazolidione  conjugate  was  more  profound.  The  majority  of  the  12  compounds 
were  significantly  more  potent  than  the  combination  of  linezolid  and  pretomanid,  with  the 
exception of compound 16. Several compounds (8a, 8b, 11a, 14c, 19a, 19b and 19c) were 10–100‐fold 
more potent against the majority of the tested strains than the combination. 
One  of  the  limitations  of  the  current  study  is  that  compounds  14a–d,  16  and  19a–c  are 
diastereomers which may have an impact to the interpretation of the SARs, as one diastereomer may 
be more active than another. 
The  underlying  mechanism  for  the  apparent  synergistic  effect  of  this  conjugate  series  is  still 
unclear. A number of hypotheses are currently under consideration. The first is that conjugation of a 
nitroimidazole  to  the  oxazolidinone  simply  makes  the  oxazolidinone  more  potent.  The 
nitroimidazole  group  plays  the  role  of  a  substituent  that  makes  the  oxazolidinone  bind  to  the 
ribosomal RNA better. This hypothesis appears to be less plausible, as the synergistic effect was only 
observed  with  anaerobic  bacteria.  We  did  not  observe  the  same  level  of  improvement  of  potency 
against  aerobic  bacteria  Enterococcus  faecium  and  Staphylococcus  aureus  (Table  2).  The  second 
hypothesis is that the conjugate molecules bring additional nitroimidazole inside the cells by better 
penetration  or  avoidance  of  efflux.  A  third  hypothesis  is  that  the  nitroimidazole  moiety  acts 
synergistically when conjugated to an oxazolidinone pharmacophore. The high binding affinity of 
the  oxazolidinone  moiety  to  ribosomes  or  ribosomal  components  could  bring  the  reactive  species 
generated  from  the  nitroimidazole  moiety  into  close  affinity  with  the  transcription/translation 
machinery  and  make  them  work  more  efficiently.  This  includes  the  possibility  for  irreversible 
covalent linking to the ribosome or other enzymes associated with intrinsic oxazolidinone resistance. 
The last two hypotheses are supported by the mechanism‐of‐action study which indicated that both 
the nitroimidazole and the oxazolidinone functions contribute the antibacterial activity inside a M. 
tuberculosis cell (Table 1). 

3. Materials and Methods 

3.1. Chemistry 
General: Reference compounds linezolid, levofloxacin and metronidazole were purchased from 
ChemPacific  (Baltimore,  MD,  USA)  or  Sigma‐Aldrich  (St.  Louis,  MO,  USA).  Pretomanid  (PA‐824) 
and compound 5 were prepared according to published procedures [7]. All other compounds were 
synthesized by TenNor Therapeutics (Suzhou, China). 
All starting materials were either purchased from commercial sources or prepared according to 
published  procedures.  Operations  involving  moisture‐  and/or  oxygen‐sensitive  materials  were 
conducted under an atmosphere of nitrogen. Flash chromatography was performed using silica gel 
60  as  normal  phase  adsorbent  or  C18  silica  gel  as  reverse  phase  adsorbent.  Nuclear  magnetic 
resonance  (NMR)  spectra  were  recorded  on  a  Varian  (Palo  Alto,  CA,  USA)  400  MHz  magnetic 
resonance  spectrometer.  1H‐NMR  chemical  shift  is  given  in  parts  per  million  (δ)  downfield  from 
TMS.  1H‐NMR information was tabulated in the following format: number of protons, multiplicity 
(s, singlet; d, doublet; t, triplet; q, quartet; m, multiplet; td, triplet of doublet; dt, doublet of triplet), 
coupling constant(s) (J) in hertz. The prefix app is occasionally applied in cases where the true signal 
multiplicity  is  unresolved,  and  prefix  br  indicates  a  broad  signal.  A  high  performance  liquid 
chromatography  (HPLC)  analysis  for  the  final  compound  was  performed  on  an  Agilent  1100 
instrument using a Waters (Milford, MA, USA) Xterra RP18 column (5 μm, 4.6 mm × 250 mm) and 
Molecules 2020, 25, 2431  8  of  14 

gradient elution (solvent A, 20 mM NaH2PO4/acetonitrile, 60:40 v/v; solvent B, acetonitrile). HPLC 
purities for the final compound were ≥95%. 
(R)‐3‐(3‐fluoro‐4‐(6‐(((S)‐2‐nitro‐6,7‐dihydro‐5H‐imidazo[2,1‐b][1,3]oxazin‐6‐yl)oxy)pyridin‐3‐yl)phe
nyl)‐5‐(hydroxymethyl)oxazolidin‐2‐one  (8a)  [11].  To  a  solution  of 
(S)‐6‐((5‐bromopyridin‐2‐yl)oxy)‐2‐nitro‐6,7‐dihydro‐5H‐imidazo[2,1‐b][1,3]oxazine  (1.01  g,  2.96 
mmol)  and 
(R)‐3‐(3‐fluoro‐4‐(4,4,5,5‐tetramethyl‐1,3,2‐dioxaborolan‐2‐yl)phenyl)‐5‐(hydroxymethyl)‐oxazolidin
‐2‐onein DMF (30 mL) was added a solution of K2CO3 (0.90 g, 6.51 mmol) in water (1 mL) and the 
mixture was purged with nitrogen. Pd(PPh3)4 (0.17 g, 0.15 mmol) was then added and the mixture 
was warmed with stirring under nitrogen at 80 °C for 3 h. The solvents were completely removed 
under reduced pressure and the residue was partitioned between EtOAc and water. The extract was 
worked  up  and  chromatographed  on  silica.  Elution  with  EtOAc  gave  four  fractions,  then  elution 
with  (1:20)  MeOH/DCM  gave  8a  as  a  yellow  powder  (460  mg,  33%).  This  general  procedure  of 
Suzuki coupling reaction was also applied for the synthesis of 8b, 11b, 14a–d, and 19a–c.  1H‐NMR 
(400 MHz, DMSO) δ 8.38 (s, 1H), 8.06(s, 1H), 7.94–7.91 (m, 1H), 7.63 (dt, J = 13.6, 2.4 Hz, 1H), 7.57 (d, 
J  =  8.8  Hz,  1H),  7.46–7.43  (m,  1H),  6.97  (d,  J  =  9.2  Hz,  1H),  5.76  (s,  1H),  5.24  (t,  J  =  5.6  Hz,  1H), 
4.74–4.67 (m, 2 H), 4.48–4.38 (m, 2 H), 4.13–4.09 (m, 1H), 3.86 (dd, J = 8.8, 6.0 Hz, 1H), 3.70–3.64 (m, 
1H), 3.56–3.52 (m, 1H), 3.14 (d, J = 5.2 Hz, 1H). LC‐MS (ESI): m/z = 472 (M + H)+. 
(R)‐3‐(3‐fluoro‐4‐(2‐(((S)‐2‐nitro‐6,7‐dihydro‐5H‐imidazo[2,1‐b][1,3]oxazin‐6‐yl)oxy)pyrimidin‐5‐yl)p
henyl)‐5‐(hydroxymethyl)oxazolidin‐2‐one (8b) [11]. The title compound was prepared by following the 
same  procedure  as  that  described  for  the  preparation  of  8a,  except 
(S)‐6‐((5‐bromopyrimidin‐2‐yl)oxy)‐2‐nitro‐6,7‐dihydro‐5H‐imidazo[2,1‐b][1,3]oxazine  was  used 
instead  of  (S)‐6‐((5‐bromopyridin‐2‐yl)oxy)‐2‐nitro‐6,7‐dihydro‐5H‐imidazo[2,1‐b][1,3]oxazine.  (580 
mg, 41%). 1H‐NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.86 (s, 2 H), 8.06 (s, 1H), 7.68 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.66 (t, J = 
2.8 Hz, 1H), 7.47 (dd, J = 8.8, 2.4 Hz, 1H), 5.74 (s, 1H), 5.23 (t, J = 5.6 Hz,1H), 4.77–4.70 (m, 2 H), 4.47 (s, 
1H),  4.1  1  (t,  J  =  9.0  Hz,  1H),  3.86  (dd,  J  =  8.8,  6.0  Hz,  1H),  3.71–3.65  (m,  1H),  3.57–3.53  (m,  1H), 
3.38–3.35 (m, 1H). LC‐MS (ESI): m/z = 473 (M + H)+. 
N‐(((S)‐3‐(2‐fluoro‐4′‐((((S)‐2‐nitro‐6,7‐dihydro‐5H‐imidazo[2,1‐b][1,3]oxazin‐6‐yl)oxy)methyl)‐[1,1′‐
biphenyl]‐4‐yl)‐2‐oxooxazolidin‐5‐yl)methyl)acetamide  (11a)  [11].  To  a  solution  of 
(S)‐6‐((4‐bromobenzyl)oxy)‐2‐nitro‐6,7‐dihydro‐5H‐imidazo[2,1‐b][1,3]oxazine (70.4 mg, 0.21 mmol) 
and  (S)‐N‐((3‐(3‐fluoro‐4‐(4,4,5,5‐tetramethyl‐1,3,2‐dioxaborolan‐2‐yl)phenyl)‐2‐oxooxazolidin‐5‐yl) 
methyl)acetamide (86.0 mg, 0.227 mmol) in DMF (8 mL) was added a solution of Na2CO3 (57.0 mg, 
0.538 mmol) in water (1 mL) and the mixture was purged with nitrogen. Pd(PPh3)4 (24.0 mg, 0.021 
mmol) was then  added  and  the  mixture  was warmed  with stirring  under  nitrogen at 85  °C for 90 
min.  The  solvents  were  completely  removed  under  reduced  pressure  and  the  residue  was 
partitioned between EtOAc and water. The extract was worked up and chromatographed on silica. 
Elution  with  EtOAc  gave  four  fractions,  then  elution  with  (1:9)  MeOH/EtOAc  gave  11a  as  an 
off‐white powder. (59.4 mg, 44%).  1H‐NMR (DMSO‐D6, 400 MHz) δ 8.22 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 8.07 (s, 
1H), 7.60–7.50 (m, 4H), 7.39 (dd, J = 8.6, 2.2 Hz, 1H), 7.15 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 5.29 (br s, 1H), 4.79–4.70 
(m, 2H), 4.70–4.64 (m, 2H), 4.42 (dd, J = 13.8, 3.2 Hz, 1H), 4.35 (br d, J = 13.8 Hz, 1H), 4.16 (t, J = 9.0 
Hz, 1H), 40.03 (M, 1H), 3.78 (dd, J = 9.2, 6.5 Hz, 1H), 3.43 (t, J = 5.5 Hz, 2H), 1.84 (s, 3H). LC‐MS (ESI): 
m/z = 526 (M + H)+. 
(R)‐3‐(3‐fluoro‐4‐(6‐((((S)‐2‐nitro‐6,7‐dihydro‐5H‐imidazo[2,1‐b][1,3]oxazin‐6‐yl)oxy)methyl)pyridin‐
3‐yl)phenyl)‐5‐(hydroxymethyl)oxazolidin‐2‐one  (11b)  [11].  The  title  compound  was  prepared  by 
following  the  same  procedure  as  that  described  for  the  preparation  of  8a  except 
(S)‐6‐((5‐bromopyridin‐2‐yl)methoxy)‐2‐nitro‐6,7‐dihydro‐5H‐imidazo[2,1‐b][1,3]oxazine  was  used 
instead  of  (S)‐6‐((5‐bromopyridin‐2‐yl)oxy)‐2‐nitro‐6,7‐dihydro‐5H‐imidazo[2,1‐b][1,3]oxazine.  (360 
mg, 38%).  1H‐NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.68 (s, 1H), 8.04 (s, 1H), 7.96 (dt, J = 8.8, 1.6 Hz, 1H),  7.65 
(dd, J = 13.6, 2.4 Hz, 1H), 7.60 (d, J = 8.8 Hz, IH), 7.46 (dd, J = 8.4, 2.8 Hz, 2 H), 5.74 (s, 1H), 5.24 (t, J = 
5.6 Hz, 1H), 4.77–4.69 (m, 3 H), 4.48 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 4.35–4.22 (m, 3 H), 4.12 (t, J = 9.2 Hz, 1H), 3.86 
(dd, J = 8.8, 5.6 Hz, 1H), 3.70–3.65 (m, 1H), 3.58–3.52 (m, 1H), 3.16–3.12 (m, 1H). LC‐MS (ESI): m/z = 
486 (M + H)+. 
Molecules 2020, 25, 2431  9  of  14 

(5R)‐3‐(2‐fluoro‐4′‐((2‐methyl‐6‐nitro‐2,3‐dihydroimidazo[2,1‐b]oxazol‐2‐yl)methoxy)‐[1,1′‐biphenyl]‐
4‐yl)‐5‐(hydroxymethyl)oxazolidin‐2‐one  (14a).  The  title  compound  was  prepared  by  following  the 
same  procedure  as  that  described  for  the  preparation  of  8a,  except 
(S)‐6‐((5‐bromopyridin‐2‐yl)methoxy)‐2‐nitro‐6,7‐dihydro‐5H‐imidazo[2,1‐b][1,3]oxazine  was  used 
instead  of  (S)‐6‐((5‐bromopyridin‐2‐yl)oxy)‐2‐nitro‐6,7‐dihydro‐5H‐imidazo[2,1‐b][1,3]oxazine 
(2.87g, 56.3%).  1H‐NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.14 (s, 1H), 7.67–7.26 (m, 5H), 6.96 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 
5.20 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.69 (td, J = 9.3, 3.6 Hz, 1H), 4.39–4.28 (m, 3H), 4.17 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 4.07 (t, J 
= 9.0 Hz, 1H), 3.82 (dd, J = 8.8, 6.3 Hz, 1H), 3.65 (ddd, J = 12.2, 5.4, 3.2 Hz, 1H), 3.58–3.48 (m, 1H), 1.66 
(s, 3H). LC‐MS (ESI): m/z = 485 (M + H)+. 
(5R)‐3‐(2′‐chloro‐2‐fluoro‐4′‐((2‐methyl‐6‐nitro‐2,3‐dihydroimidazo[2,1‐b]oxazol‐2‐yl)methoxy)‐[1,1′‐b
iphenyl]‐4‐yl)‐5‐(hydroxymethyl)oxazolidin‐2‐one (14b). The title compound was prepared by following 
the  same  procedure  as  that  described  for  the  preparation  of  8a,  except 
2‐((4‐bromo‐3‐chlorophenoxy)methyl)‐2‐methyl‐6‐nitro‐2,3‐dihydroimidazo[2,1‐b]oxazole was used 
instead  of  (S)‐6‐((5‐bromopyridin‐2‐yl)oxy)‐2‐nitro‐6,7‐dihydro‐5H‐imidazo[2,1‐b][1,3]oxazine  (346
mg, 66.7%). 1H‐NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.13 (s, 1H), 7.55 (dd, J = 12.5, 2.0 Hz, 1H), 7.37 (dd, J = 8.6, 
2.0 Hz, 1H), 7.28 (dd, J = 15.5, 8.5 Hz, 2H), 7.13 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 6.93 (dd, J = 8.6, 2.5 Hz, 1H), 5.20 (t, 
J = 5.6 Hz, 1H), 4.69 (dd, J = 9.1, 5.6 Hz, 1H), 4.41–4.29 (m, 3H), 4.16 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 4.08 (t, J = 9.0 
Hz, 1H), 3.82 (dd, J = 8.9, 6.1Hz, 1H), 3.69–3.60 (m, 1H), 3.58–3.49 (m, 1H), 1.65 (s, 3H). LC‐MS (ESI): 
m/z = 567 (M + H)+. 
(5R)‐3‐(3‐fluoro‐4‐(6‐((2‐methyl‐6‐nitro‐2,3‐dihydroimidazo[2,1‐b]oxazol‐2‐yl)methoxy)pyridin‐3‐yl)p
henyl)‐5‐(hydroxymethyl)oxazolidin‐2‐one  (14c).  The  title  compound  was  prepared  by  following  the 
same  procedure  as  that  described  for  the  preparation  of  8a,  except 
2‐(((5‐bromopyridin‐2‐yl)oxy)methyl)‐2‐methyl‐6‐nitro‐2,3‐dihydroimidazo[2,1‐b]oxazole  was  used 
instead of (S)‐6‐((5‐bromopyridin‐2‐yl)oxy)‐2‐nitro‐6,7‐dihydro‐5H‐imidazo[2,1‐b][1,3]oxazine (3.5 g, 
51.5%). 1H‐NMR (400 MHz, DMSO ) δ 8.34 (s, 1H), 8.15 (s, 1H), 7.94–7.87 (m, 1H), 7.68–7.55 (m, 2H), 
7.45 (dd, J = 8.6, 2.1 Hz, 1H), 6.86 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 5.22 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.74 (td, J = 5.8, 2.7 Hz, 1H), 
4.63 (s, 2H), 4.41 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 4.25–4.09 (m, 2H), 3.88 (dd, J = 8.9, 6.2 Hz, 1H), 3.70 (ddd, J = 
12.3, 5.5, 3.4 Hz, 1H), 3.58 (ddd, J = 12.3, 5.7, 4.1 Hz, 1H), 1.71 (s, 3H). LC‐MS (ESI): m/z = 486 (M + H)+. 
(5R)‐3‐(3‐fluoro‐4‐(5‐((2‐methyl‐6‐nitro‐2,3‐dihydroimidazo[2,1‐b]oxazol‐2‐yl)methoxy)pyridin‐2‐yl)p
henyl)‐5‐(hydroxymethyl)oxazolidin‐2‐one  (14d).  The  title  compound  was  prepared  by  following  the 
same  procedure  as  that  described  for  the  preparation  of  8a,  except 
2‐(((6‐bromopyridin‐3‐yl)oxy)methyl)‐2‐methyl‐6‐nitro‐2,3‐dihydroimidazo[2,1‐b]oxazole  was  used 
instead  of  (S)‐6‐((5‐bromopyridin‐2‐yl)oxy)‐2‐nitro‐6,7‐dihydro‐5H‐imidazo[2,1‐b][1,3]oxazine  (280
mg, 57.7%). 1H‐NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.32 (d, J = 2.9 Hz, 1H), 8.16 (d, J = 17.1 Hz, 1H), 7.90 (t, J = 
9.0 Hz, 1H), 7.69 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.58 (dd, J = 14.2, 1.9 Hz, 1H), 7.48–7.38 (m, 2H), 5.21 (t, J = 5.6 Hz, 
1H), 4.70 (dd, J = 9.0, 5.7 Hz, 1H), 4.40 (dt, J = 11.0, 9.4 Hz, 3H), 4.17 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 4.08 (t, J = 9.0 
Hz, 1H), 3.83 (dd, J = 8.7, 6.3 Hz, 1H), 3.65 (ddd, J = 12.2, 5.2, 3.4 Hz, 1H), 3.59–3.49 (m, 1H), 1.67 (s, 
3H). LC‐MS (ESI): m/z = 486 (M + H)+. 
(5R)‐3‐(3‐fluoro‐4‐((5‐((2‐methyl‐6‐nitro‐2,3‐dihydroimidazo[2,1‐b]oxazol‐2‐yl)methoxy)pyridin‐2‐yl)o
xy)phenyl)‐5‐(hydroxymethyl)oxazolidin‐2‐one (16). 
2‐(((5‐bromopyridin‐2‐yl)oxy)methyl)‐2‐methyl‐6‐nitro‐2,3‐dihydroimidazo[2,1‐b]oxazole (532 mg, 1.5 
mmol), (R)‐3‐(3‐fluoro‐4‐hydroxyphenyl)‐5‐(hydroxymethyl)oxazolidin‐2‐one (376 mg, 1.65 mmol ), 
Potassium  carbonate  (622  mg,  4.5mmol),  Cuprous  iodide  (286  mg,  1.5  mmol)  and 
N,N,N′,N′‐Tetramethylethylenediamine  (TMEDA)  (174  mg,  1.5  mmol)  were  added  in 
N,N‐dimethylformamide (5 mL). The mixture was stirred at 90 °C for 12 h. The mixture was cooled 
to room temperature, then poured into water (50 mL), the solvent was filtered and the filtered solid 
was  pump  dried.  The  crude  product  was  further  purified  by  silica  chromatography  column 
(DCM:MeOH  =  100:2  )  to  give 
(5R)‐3‐(3‐fluoro‐4‐((5‐((2‐methyl‐6‐nitro‐2,3‐dihydroimidazo‐[2,1‐b]oxazol‐2‐yl)methoxy)pyridin‐2‐y
l)oxy)phenyl)‐5‐(hydroxymethyl)oxazolidin‐2‐one(200  mg,  26.6%).  1H  NMR  (500  MHz,  DMSO)  δ 
8.29 (s, 1H), 8.05 (s, 1H), 7.88 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.64–7.50 (m, 2H), 7.41 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.92 (d, J = 
8.5 Hz, 1H), 4.70 (s, 1H), 4.48 (s, 2H), 4.23–4.01 (m, 3H), 3.83 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 3.65 (d, J = 12.4 Hz, 
Molecules 2020, 25, 2431  10  of  14 

1H), 3.53 (d, J = 12.2 Hz, 1H), 2.40–2.29 (m, 1H), 2.22–2.09 (m, 1H), 1.46 (s, 3H). LC‐MS (ESI): m/z = 502 
(M + H)+. 
(5R)‐3‐(3‐fluoro‐4‐(6‐((2‐nitro‐6,7‐dihydro‐5H‐imidazo[2,1‐b][1,3]oxazin‐7‐yl)methoxy)pyridin‐3‐yl)p
henyl)‐5‐(hydroxymethyl)oxazolidin‐2‐one  (19a).  The  title  compound  was  prepared  by  following  the 
same  procedure  as  that  described  for  the  preparation  of  8a,  except 
7‐(((5‐bromopyridin‐2‐yl)oxy)methyl)‐2‐nitro‐6,7‐dihydro‐5H‐imidazo[2,1‐b][1,3]oxazine  was  used 
instead  of  (S)‐6‐((5‐bromopyridin‐2‐yl)oxy)‐2‐nitro‐6,7‐dihydro‐5H‐imidazo[2,1‐b][1,3]oxazine  (162
mg, 56.3%). 1H‐NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.32 (s, 1H), 8.06 (s, 1H), 7.91 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.58 (dd, J = 
22.0, 11.8 Hz, 2H), 7.42 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.97 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 5.21 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 4.91 (s, 1H), 
4.71 (d, J = 2.9 Hz, 1H), 4.57 (dt, J = 12.1, 7.7 Hz, 2H), 4.21–4.01 (m, 3H), 3.89–3.80 (m, 1H), 3.66 (d, J = 
11.5 Hz, 1H), 3.60–3.49 (m, 1H), 2.29 (d, J = 13.4 Hz, 1H), 2.18 (dd, J = 15.1, 9.6 Hz, 1H). LC‐MS (ESI): 
m/z = 486 (M + H)+. 
(5R)‐3‐(3‐fluoro‐4‐(2‐((2‐nitro‐6,7‐dihydro‐5H‐imidazo[2,1‐b][1,3]oxazin‐7‐yl)methoxy)pyrimidin‐5‐yl
)phenyl)‐5‐(hydroxymethyl)oxazolidin‐2‐one (19b). The title compound was prepared by following the 
same  procedure  as  that  described  for  the  preparation  of  8a,  except 
7‐(((5‐bromopyrimidin‐2‐yl)oxy)methyl)‐2‐nitro‐6,7‐dihydro‐5H‐imidazo[2,1‐b][1,3]oxazine  was 
used  instead  of  (S)‐6‐((5‐bromopyridin‐2‐yl)oxy)‐2‐nitro‐6,7‐dihydro‐5H‐imidazo[2,1‐b][1,3]oxazine 
(674 mg, 50.3%). 1H‐NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.81 (d, J = 0.9 Hz, 2H), 8.07 (s, 1H), 7.70–7.62 (m, 2H), 
7.48–7.41 (m, 1H), 5.22 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 5.01–4.90 (m, 1H), 4.76–4.61 (m, 3H), 4.20–4.06 (m, 3H), 3.85 
(dd, J = 8.8, 6.3 Hz, 1H), 3.66 (ddd, J = 12.3, 5.2, 3.4 Hz, 1H), 3.54 (ddd, J = 12.4, 5.6, 4.1 Hz, 1H), 2.30 
(dd, J = 11.9, 2.4 Hz, 1H), 2.24–2.10 (m, 1H). LC‐MS (ESI): m/z = 487 (M + H)+. 
(5R)‐3‐(3‐fluoro‐4‐(6‐((7‐methyl‐2‐nitro‐6,7‐dihydro‐5H‐imidazo[2,1‐b][1,3]oxazin‐7‐yl)methoxy)pyrid
in‐3‐yl)phenyl)‐5‐(hydroxymethyl)oxazolidin‐2‐one  (19c).  The  title  compound  was  prepared  by 
following  the  same  procedure  as  that  described  for  the  preparation  of  8a  except 
7‐(((5‐bromopyridin‐2‐yl)oxy)methyl)‐7‐methyl‐2‐nitro‐6,7‐dihydro‐5H‐imidazo[2,1‐b][1,3]oxazine 
was  used  instead  of 
(S)‐6‐((5‐bromopyridin‐2‐yl)oxy)‐2‐nitro‐6,7‐dihydro‐5H‐imidazo[2,1‐b][1,3]oxazine (260 mg, 68.6%). 
1H‐NMR (500 MHz, DMSO) δ 8.29 (s, 1H), 8.05 (s, 1H), 7.88 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.64–7.50 (m, 2H), 7.41 

(d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.92 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 4.70 (s, 1H), 4.48 (s, 2H), 4.11 (dt, J = 17.0, 7.2 Hz, 3H), 3.83 
(t, J = 7.3 Hz, 1H), 3.65 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 3.53 (d, J = 12.2 Hz, 1H), 2.40–2.29 (m, 1H), 2.22–2.09 (m, 
1H), 1.46 (s, 3H). LC‐MS (ESI): m/z = 500 (M + H)+. 

3.2. Biology 

3.2.1. Bacterial Strains   
The bacterial strains used in the current study are listed in Table 4. Strains in the Mycobacterium 
tuberculosis isogenic resistant mutant panel used for the mechanism of action study were generated 
and tested at Beijing Tuberculosis and Thoracic Tumor Research Institute (BTTTRI, Bejing, China). 
Strains of the spectrum panel were all ATCC stains, and testing was conducted at HD Biosciences 
(Shanghai,  China).  Strains  of  the  anaerobic  bacterial  panel  were  ATCC  strains,  and  the  test  was 
conducted at Micomyx Inc. (Kalamazoe, MI, USA). 
Molecules 2020, 25, 2431  11  of  14 

Table 4. List of bacterial strains used in the current study. 

Panel  Organism  ATCC No.  Testing Facility 

Enterococcus faecalis (Ef)  700221 
Staphylococcus aureus (Sa)  292213 
Klebciella pneumonia (Kp)  43816 
Spectrum Panel  Acinetobacter baumannii (Ab)  19606  HD Biosciences 
Pseudomonas aeruginosa (Pa)  27853 
Escherichia coli (Ec)  25922 
Clostrium difficile (Cd)  43255 
M. tuberculosis H37Rv (Wild‐Type)  27294 
M. tuberculosis  M. tuberculosis P1 (Pretomanid‐R)  Isogenic 
Isogenic Resistant  M. tuberculosis P3 (Pretomanis‐R)  Isogenic  BTTTRI 
Mutant Panel  M. tuberculosis L1 (Linezolid‐R)  Isogenic 
M. tuberculosis L3 (Linezolid‐R)  Isogenic 
Clostridium difficile (Cd)  700057 
Lactobacillus acidophilus (Lc)  4356 
Eggerthella lenta (El)  43055 
Gardnerella vaginalis (Gv)  14018 
Peptostreptococcus micros (Pm)  23195 
Porphyromonas asaccharolytica (Pas)  M3553 
Anaerobic Bacterial  Propionibacterium acnes (Pac)  11892 
Micromyx 
Panel  Bacteroides fragilis (Bf)  25285 
Bifidobacterium longum (Bl)  15707 
Fusobacterium nucleatum (Fn)  10953 
Mobiluncus mulieris (Mm)  35243 
Prevotella bivia (Pb)  29303 
Veillonella parvula (Vp)  17745 
Helicobacter pylori (Hp)  43504 

3.2.2. Generation of Isogenic Mutant Panel 
The  methods  to  induce  and  characterize  the  Mtb  isogenic  mutant  strains  resistant  to 
pretomanid or linezolid have been described previously [12,13]. Briefly, 200 μL of 104–105 CFU/mL 
of M. tuberculosis H37Rv (ATCC27294) in 7H9 liquid culture medium at logarithmic growth phase 
were  evenly  spread  on a  7H11  solid  medium  containing  1  MIC  (0.07  μg/mL) of  pretomanid and 
blank  control  medium.  After  sealing,  the  plates  were  incubated  at  37  °C  under  5%  CO2  for  3  to  4 
weeks.  Single  colonies  with  good  growth  were  collected  from  the  drug‐containing  solid  medium, 
milled  and  diluted  to  a  concentration  of  104–105  CFU/mL,  and  then  inoculated  onto  7H11  solid 
medium with pretomanid at 2 MIC (0.15 μg/mL) and blank control medium. The plates were then 
incubated  under  the  same  conditions  for  another  3  to  4  weeks  to  observe  the  growth  of  single 
colonies. A single colony with robust growth was collected from the drug‐containing medium and 
further subcultured on the drug‐containing solid medium with a 2‐fold increase of concentration of 
pretomanid until the selection of a single colonies that grew well on solid medium with pretomanid 
concentration of 16 MIC. The phenotypic confirmation of the pretomanid resistant mutant strains 
was  performed  by  the  Alamar  Blue  double  dilution  method  [14].  The  genotypic  change  of  the 
resistant mutant strains were confirmed to be the T265C point mutation (TAC→CAC, Y89H) in the 
ddn  gene.  A  similar  sequential  drug  selection  method  was  applied  to  obtain  linezolid  resistant 
mutant trains.  The  genotypic  change  of  the linezolid  resistant  mutant  strains was  found  to  be the 
point mutation of the rplC (T460C). 

3.2.3. Media   
Media  were  prepared  according  to  guidelines  from  CLSI.  The  test  medium  used  for  the 
anaerobic  bacterial  was  supplemented  Brucella  broth  (BD,  Lot  No.  6278735)  containing  5  μg/mL 
Molecules 2020, 25, 2431  12  of  14 

hemin  (Sigma  (St. Louis, MO. USA),  Lot  No.  SLBC4685V),  1  mg/mL  Vitamin  K1  (Sigma,  Lot  No. 
MKBN5958V), and 5% (v/v) laked horse blood (LHB, Cleveland Scientific (Bath, OH, USA), Lot No. 
385663).  Brucella  broth  (BD)  supplemented  with  10%  fetal  bovine  serum  (FBS,  Gibco,  Lot  No. 
1709261) was used for testing of H. pylori. Cation‐adjusted Mueller Hinton Broth (CAMHB) media 
was  used  for  the  spectrum  determination  against  the  spectrum  panel.  Difco  Middlebrook 
(Waltham, MA, USA) 7H9 Broth (Catalog No. 271310) supplemented with 0.2% (v/v) glycerol, 0.05% 
Tween  80,  and  10%  (v/v)  albumin‐dextrosecatalase  (BBL  Middlebrook  (Waltham, MA, USA)  ADC 
Enrichment,  Catalog  No.  212352)  (7H9‐ADC‐T)  was  used  for  the  MIC  assay  against  the  M. 
tuberculosis isogenic resistant mutant panel. 

3.2.4. Minimum Inhibitory Concentration Testing 
The MIC test against the spectrum panel was conducted at HB Biosciences, following the broth 
microdilution  method  per  CLSI  guidance.  The  six  ESKAPE  ATCC  strains  were  recovered  in 
Trypticase Soy Agar (TSA) plates and tested with drug in CAMHB. Anaerobic bacterial C. difficile 
strains  were  recovered  on  TSA  agar,  grown  and  tested  with  compounds  in  Blucella  broth  with  5 
μg/mL chlorhematin and 10 μg/mL vitamin K1 in an anaerobic chamber. 
The MIC assay against the Mtb isogenic resistant mutant strains was performed at BTTTRI by 
the  microplate  Alamar  blue  assay  [14].  Pretomanid,  linezolid  and  metronidazole  were  used  as 
comparators. The H37Rv strain and its derived isogenic resistant mutant strains were grown for 1–2 
weeks at 37 °C and adjusted to a turbidity of McFarland 1 at 107 CFU/mL and diluted 1:20. Twofold 
dilutions of testing compounds and comparators were prepared in 7H9‐ADC‐TG in volumes of 100 
μL in 96‐well, black, clear‐bottom microplates (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA). Bacterial 
cells (100 μL containing 2 × 105 CFU) was added, yielding a final testing volume of 200 μL. The plates 
were incubated at 37 °C, and on day 7, 12.5 μL  of 20%  Tween 80  and 20 μL  of Alamar blue  were 
added to all wells. After incubation at 37 °C for 16 to 24 h, the fluorescence was read at an excitation 
of 530 nm and an emission of 590 nm. The MIC was defined as the lowest concentration effecting a 
reduction in fluorescence of ≥90% relative to the mean of replicate bacterium‐only controls. 
The MIC assay against anaerobic bacterial strains was performed at Micromyx by following the 
procedure described by CLSI [15–17]. A standardized inoculum of each organism was prepared as 
per CLSI methods. Colonies were picked from the primary plate and a suspension was prepared to 
equal  to  a  0.5  McFarland  turbidity  standard.  Anaerobic  suspensions  were  diluted  1:10  in  Brucella 
broth  with  5%  laked  horse  blood, and  each  well  was  inoculated with  10  μL  using  a  multichannel 
pipette in the Bactron anaerobe chamber,  resulting in a  final  cell density  of  approximately 5  105 
CFU/mL (5  104 CFU/mL for Clostridium spp.). For the H. pylori strain, colonies were picked from the 
primary  plate  and  a  suspension  was  prepared  to  equal  a  2.0  McFarland  turbidity  standard. 
Suspensions  were  diluted  1:15  in  Brucella  broth  with  10%  FBS,  and  then  transferred  to 
compartments  of  sterile  reservoirs  divided  by  length  (Beckman  Coulter).  The  Biomek  2000  (Brea, 
CA, United States) was used to inoculate the plates. Daughter plates were placed on the Biomek 2000 
work  surface  in  reverse  orientation  so  that  plates  were  inoculated  from  low  to  high  drug 
concentration.  The  Biomek  2000  delivered  10  μL  of  standardized  inoculum  into  each  well  of  the 
appropriate  daughter  plate  for  an  additional  1:20  dilution.  Anaerobe  plates  were  placed  in  an 
anaerobic box with GasPak sachets (BD), and were incubated anaerobically for 46–48 h at 35–37 °C. 
H.  pylori  was  incubated  for  72  h  in  a  microaerophilic  atmosphere  using  boxes  with  GasPak  EZ 
Campy sachets (BD) prior to reading. After incubation, plates were viewed from the bottom using a 
plate  viewer.  An  uninoculated  solubility  control  plate  was  observed  for  evidence  of  drug 
precipitation. MIC values were read and recorded as the lowest concentration of drug that inhibited 
the visible growth of the organism. 

3.2.5. Cytotoxicity Assay   
The  cytotoxicity  assay  followed  the  previously  published  protocol  [14].  Briefly,  Vero  cells  in 
RPMI  1640  medium  supplemented  with  10%  fetal  bovine  serum  (FBS)  were  incubated  in  a 
humidified atmosphere of 5% CO2 at 37 °C to reach confluent, and then diluted to 4 × 105 cells/mL. 
Molecules 2020, 25, 2431  13  of  14 

Threefold serial dilutions of the stock solutions resulted in final concentrations of 64 to 0.26 μg/mL in 
a final  volume of 100 μL. Cytotoxicity  testing  was performed in a transparent  96‐well  microplate. 
After  incubation  at  37  °C  for  48  h,  the  medium  was  removed,  and  the  monolayers  were  washed 
twice with 100 μL of warm Hanks balanced salt solution (HBSS). Warm medium and freshly made 
methyl‐thiazolyldiphenyl‐tetrazolium bromide (MTT) were added to each well, and then the plates 
were incubated for 4 h, after which the absorbance was determined at 492 nm. 

4. Conclusions 
A series of 4‐nitroimidazole and oxazolidione conjugate molecules was designed, synthesized 
and evaluated based on previous structure‐activity relationship information. The dual mechanism of 
action  of  this  series  was  demonstrated  against  Mycobacterium  tuberculosis  by  utilizing  an  isogenic 
mutant panel resistant to either pretomanid or linezolid. Compounds in the series are highly active 
against a panel of clinically important anaerobic bacteria. A strong synergistic effect was observed 
compared  to  the  combination  of  linezolid  and  pretomanid.  It  can  be  concluded  that  the 
nitroimidazole‐oxazolidinone  conjugate  molecules  hold  potential  for  the  treatment  of  anaerobic 
bacterial infections. 
Author  Contributions:  Z.M.,  C.Z.D.,  A.S.L.,  A.M.U.,  C.B.C.  and  W.A.D.  conceived  the  compound  series  and 
were responsible for the initial design, synthesis and evaluation of the conjugate series. Z.Z., D.W., J.D. and Q.Z. 
conducted the synthesis and characterization of the conjugate molecules of the current study. S.H., X.W. and 
Y.Y. coordinated and oversaw compound testing. Y.L. generated and tested against the Mtb isogenic resistant 
mutant panel. All authors have read and agreed to the published version of the manuscript. 

Funding: We thank the National Science and Technology Project of China (No.2015ZX09102007‐007) for partial 
financial support of this project. 

Conflicts of Interest: The authors declare no conflicts of interest. 

References 
1. Hashemian, S.M.R.; Farhadi, T.; Ganjparvar, M., Linezolid: A review of its properties, function, and use in 
critical care. Drug Des. Devel. Ther. 2018, 12, 1759–1767. 
2. Cellitti, S.E.; Shaffer, J.; Jones, D.H.; Mukherjee, T.; Gurumurthy, M.; Bursulaya, B.; Boshoff, H.I.; Choi, I.; 
Nayyar,  A.;  Lee,  Y.S.;  et  al.  Structure  of  Ddn,  the  deazaflavin‐dependent  nitroreductase  from 
Mycobacterium tuberculosis involved in bioreductive activation of PA‐824. Structure 2012, 20, 101–112. 
3. Singh, R.; Manjunatha, U.; Boshoff, H.I.M.; Ha, Y.H.; Niyomrattanakit, P.; Ledwidge, R.; Dowd, C.S.; Lee, 
I.Y.; Kim, P.; Zhang, L.; et al. PA‐824 kills nonreplicating Mycobacterium tuberculosis by intracellular NO 
release. Science 2008, 322, 1392–1395. 
4. Conradie,  F.;  Diacon,  A.H.;  Ngubane,  N.;  Howell,  P.;  Everitt,  D.;  Crook,  A.M.;  Mendel,  C.M.;  Egizi,  E.; 
Moreira,  J.;  Timm,  J.;  et  al.  Treatment  of  highly  drug‐resistant  pulmonary  tuberculosis.  N.  Engl.  J.  Med. 
2020, 382, 893–902. 
5. Ma,  Z.;  Lynch,  A.S.  Development  of  a  dual‐acting  antibacterial  agent  (TNP‐2092)  for  the  treatment  of 
persistent bacterial infections. J. Med. Chem. 2016, 59, 6645–6657. 
6. Ippolito,  J.A.;  Kanyo,  Z.F.;  Wang,  D.;  Franceschi,  F.J.;  Moore,  P.B.;  Steitz,  T.A.;  Duffy,  E.M.  Crystal 
structure of the oxazolidinone antibiotic linezolid bound to the 50S ribosomal subunit. J. Med. Chem. 2008, 
51, 3353–3356. 
7. Varshney, V.; Mishra, N.N.; Shukla, P.K.; Sahu, D.P. Synthesis of nitroimidazole derived oxazolidinones 
as antibacterial agents. Eur. J. Med. Chem. 2010, 45, 661–666. 
8. Markad, S.D.; Kaur, P.; Kishore, R.B.K.; Chinnapattu, M.; Raichurkar, A.; Nandishaiah, R.; Panda, M.; Iyer, 
P.S.  Novel  lead  generation  of  an  anti‐tuberculosis  agent  active  against  non‐replicating  mycobacteria: 
Exploring hybridization of pyrazinamide with multiple fragments. Med. Chem. Res. 2015, 24, 2986–2992. 
9. Goto,  F.;  Takemura,  N.;  Otani,  T.;  Hasegawa,  T.;  Tsubouchi,  H.;  Utsumi,  N.;  Fujita,  S.;  Kuroda,  H.; 
Shitsuta, T.; Sasaki, H.  1‐Substituted‐4‐Nitroimidazole  Compound  and Process  for Producing  the  Same. 
U.S. Patent US7368579B2, 6 May 2008. 
10. Thompson,  A.M.;  Denny,  W.A.;  Blaser,  A.;  Ma,  Z.  Nitroimidazooxazine  and  Nitroimidazooxazole 
Analogues and Their Uses. U.S. Patent US8293734B2, 23 October 2012. 
Molecules 2020, 25, 2431  14  of  14 

11. Ding,  C.Z.;  Lu,  G.;  Combrink,  K.;  Chen,  D.D.;  Song,  M.;  Wang,  J.;  Ma,  Z.;  Palmer,  B.D.;  Blaser,  A.; 
Thompson,  A.M.  Bicyclic  Nitroimidazole‐Substituted  Phenyl  Oxazolidinones.  U.S.  Patent  US7666864B2, 
23 February 2010. 
12. Hu, M.H.; Wang, B.; Fu, L.; Xu, J.; Lu, Y. Induction and stability of Mycobacterium tuberculosis resistance to 
PA‐824 in vitro. J. Chin. Ant. 2011, 42, 144–148. 
13. Hu,  M.H.;  Wang,  B.;  Fu,  L.;  Xu,  J.;  Lu,  Y.  Induction  in  vitro  and  stability  of  Mycobacterium  tuberculosis 
resistance to Linezolid. Chin. J. Antibio. 2017, 39, 400–405. 
14. Lu,  Y.;  Zheng,  M.;  Wang, B.;  Fu,  L.;  Zhao,  W.; Li,  P.;  Xu,  J.;  Zhu,  H.;  Jin,  H.;  Yin,  D.;  et  al.  Clofazimine 
analogs  with  efficacy  against  experimental  tuberculosis  and  reduced  potential  for  accumulation. 
Antimicrob. Agents Chemother. 2011, 55, 5185–5193. 
15. Methods for Antimicrobial Dilution and Disk Susceptibility Testing of Infrequently Isolated or Fastidious Bacteria; 
Approved Guideline Second Edition; CLSI Document M45‐A2; Clinical and Laboratory Standards Institute: 
Wayne, PA, USA, 2010. 
16. Methods for Antimicrobial Susceptibility Testing of Anaerobic Bacteria; Approved Standard‐Eighth Edition; CLSI 
Document M11‐A8; Clinical and Laboratory Standards Institute: Wayne, PA, USA, 2012. 
17. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty‐Seventh Informational Supplement; CLSI 
Document M100‐S27; Clinical and Laboratory Standards Institute: Wayne, PA, USA, 2017. 

Sample Availability: All samples of the compounds are available from the authors. 

©  2020  by  the  authors.  Licensee  MDPI,  Basel,  Switzerland.  This  article  is  an  open 
access  article  distributed  under  the  terms  and  conditions  of  the  Creative  Commons 
 
Attribution (CC BY) license (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).